在經處理之2週齡小鼠（第9組），經過30週Phe含量維持在≤360 µM之臨床相對含量。 在第9組（經過30週）、第10組（經過42週）及第11組（經過42週）中觀察到血清Tyr濃度相應的增加（圖11D）。 此等數據顯示劑量為1E14 vg/kg之封裝於AAVHSC15內的人類設計載體足夠在幼鼠肝臟生長期間提供持續療效，且該效果在施用後維持至少30週。 圖11F顯示在第2、4及10週齡以人類設計載體處理之小鼠肝臟檢測到的載體基因體含量。 圖11J顯示在第2、4及10週齡以人類設計載體處理之小鼠肝臟檢測到的mRNA含量。
在某些實施例中，3’同源臂與第二基因體區域具有100%之核苷酸序列一致性。 在某些實施例中，5’及3’同源臂中的每一者分別與第一及第二靶基因座側翼基因體區域（例如在PAH基因中的靶基因座）至少約90%（例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%）一致。 在某些實施例中，5’及3’同源臂中的每一者分別與第一及第二靶基因座側翼基因體區域（例如在PAH基因中的靶基因座）100%一致。 在某些實施例中，5’同源臂及/或3’同源臂的核苷酸序列以及靶基因座側翼基因體的相對應區域的差異包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：在核苷酸序列中的非編碼差異。 在某些具體實施例中，封裝系統包含第一載體，其包含編碼一或多種AAV Rep蛋白質之第一核苷酸序列及編碼AAV衣殼蛋白質之第二核苷酸序列，及第二載體，其包含有包含rAAV基因組之第三核苷酸序列。 如在如本文中所描述之封裝系統之情形中所使用，「載體」係指一種核酸分子，其為用於將核酸引入細胞之媒劑（例如質體、病毒、黏質體、人工染色體等）。
值得注意的是，發現每個等位基因靶上插入的含量與mRNA表達含量直接相關（R平方 0.82；P＜0.02）。 在某些實施例中，第一基因體區域由比第一基因體區域所在的第一編輯窗之序列還短的序列組成。 在某些實施例中，第一基因體區域由第一基因體區域所在的第一編輯窗之序列組成。 在某些實施例中，第二基因體區域由比第二基因體區域所在的第二編輯窗之序列還短的序列組成。 在某些實施例中，第二基因體區域由第二基因體區域所在的第二編輯窗之序列組成。 內含子可包含至少一部分PAH基因之原生內含子序列，或者內含子元件可包含外源性內含子元件（例如，包含至少一種內含子序列，其來自不同物種或來自相同物種之不同基因及/或合成的內含子序列）。
本文所揭示之rAAV基因體所使用的同源臂與靶基因座（例如在PAH基因中的靶基因座）側翼基因體實質上相同。 在某些實施例中，5’同源臂與靶基因座5’端之第一基因體區域具有至少約90%（例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%）之核苷酸序列一致性。 在某些實施例中，5’同源臂與第一基因體區域具有100%之核苷酸序列一致性。 在某些實施例中，3’同源臂與靶基因座3’端之第二基因體區域具有至少約90%（例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%）之核苷酸序列一致性。
在某些具體實施例中，SUMF1編碼序列編碼包含SUMF1蛋白質之全部或實質上全部胺基酸序列之多肽。 在某些具體實施例中，SUMF1編碼序列編碼野生型SUMF1蛋白質（例如人類SUMF1蛋白質（hSUMF1））之胺基酸序列。 分子療法 在某些具體實施例中，SUMF1編碼序列編碼突變型SUMF1蛋白質（例如人類SUMF1蛋白質）之胺基酸序列，其中突變型SUMF1多肽為野生型SUMF1多肽之功能等效物，亦即，可充當野生型SUMF1多肽。 在某些具體實施例中，功能上等效的SUMF1多肽進一步包含至少一種未在野生型SUMF1多肽中發現之特徵，例如抵抗蛋白質降解之能力。
- 圖 4為顯示ARSA（-/-）小鼠之大腦中的以每個經轉導之細胞計的載體基因組之數目與以每奈克cDNA計的hARSA之複本之數目之間的相關性之作圖。
- 如於如本文所描述之封裝系統之情形下使用，「載體」係指一種核酸分子，其為用於將核酸引入細胞中之媒劑（例如質體、病毒、黏質體、人工染色體等）。
- 圖 8為顯示在靜脈內（IV）或鞘內（IT）投與封裝於AAVHSC15中之轉移載體pHMI-5000之後，後腦及中腦中之正常人類ARSA酶活性之百分比之圖。
- 圖6顯示對於以所指示之劑量投與之封裝於AAV9或AAVHSC15衣殼中之轉移載體pHMI-5000，所量測的正常人類ARSA酶活性水準之百分比。
- 圖 12C顯示為在給予封裝於AAVHSC15衣殼內之PAH-006m-LP-1劑量後不同時間點所檢測到的靶上插入頻率的圖。
- 在封裝系統之某些實施例中，第一、第二及/或第三載體含於一或多種質體內。
- 如請求項41至71中任一項之rAAV、如請求項72之醫藥組成物或如請求項73之聚核苷酸，其適用作藥劑。
此類內含子元件可增加轉基因表現，例如藉由減少轉錄緘默及增強自細胞核至細胞質之mRNA輸出。 在某些實施例中，rAAV基因體自5’至3’包含：TRE、內含子及至少一部分PAH編碼序列。 在某些實施例中，適用於本文所揭示之AAV組成物中的rAAV基因體包含可操作地連接至至少一部分PAH編碼序列的轉錄調控元件。
在某些具體實施例中，轉移基因組包含TRE及ARSA編碼序列的5’之5’反向末端重複（5′ ITR）核苷酸序列，及TRE及ARSA編碼序列的3’之3’反向末端重複（3′ ITR）核苷酸序列。 在某些具體實施例中，封裝系統進一步包含有包含一或多種輔助病毒基因之第四核苷酸序列。 在某些具體實施例中，第四核苷酸序列包含一或多種來自選自由以下組成之群組的病毒之基因：腺病毒、疱疹病毒、痘瘡病毒及細胞巨大病毒（CMV）。 在另一態樣中，本發明提供一種用於重組製備如本文所描述之AAV的方法，其中該方法含在可操作以將rAAV基因體包裹於衣殼中以形成如本文所描述之rAAV的條件下，用如本文所描述之封裝系統轉染或轉導細胞。 本文所揭示之方法尤其有利，在於其可在活體內以及活體外皆高效地在細胞中編碼PAH基因。
如本文中所使用，術語「可操作地連接」用於描述TRE與待轉錄之編碼序列之間的連接。 通常，使基因表現處於包含一或多種啟動子及/或強化子元件之TRE之控制下。 若編碼序列之轉錄由TRE控制或影響，則編碼序列「可操作地連接」至TRE。 TRE之啟動子及強化子元件可自編碼序列呈任何定向及/或距離，只要獲得所需轉錄活性即可。 如請求項77至80中任一項之封裝系統，其中該第四核苷酸序列包含一或多種來自選自由以下組成之群的病毒的基因：腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒及巨細胞病毒。
本領域中熟習此項技術者將瞭解，轉移基因組中之包含可操作地連接至ARSA編碼序列之轉錄調節元件之部分相對於ARSA編碼序列之轉錄方向可為有義或反義定向。 圖6及圖7顯示自經處理的FRG小鼠分離之肝細胞內的靶插入頻率。 圖6顯示將封裝於AAVHSC15衣殼內的人類靶向PAH-032h校正載體的插入至小鼠及人類PAH基因座，其用本文所描述的物種特異性ddPCR編輯測定法測量。 作為陽性控制組，使用小鼠特異性PAH基因座探針及用於同源插入位點的探針之間的連鎖。 在圖6中，An.1 HS係指動物1智人細胞、An.1 MM係指動物1家鼷鼠細胞、An.1 MM Pos.係指動物1家鼷鼠陽性控制組、An.2 HS係指動物2智人細胞、An.2 MM係指動物2家鼷鼠細胞及An.2 MM Pos.係指動物2家鼷鼠陽性控制組。 圖7顯示如經由橫跨左右同源臂的定量NGS測定法所測量之人類肝細胞的編輯。
在某些具體實施例中，尤其感興趣的是寡樹突神經膠質細胞，諸如脊髓之背束中之細胞。 在某些具體實施例中，尤其感興趣的是中樞神經系統中之神經膠質分佈，包括（但不限於）星形膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞、許旺細胞及其任何組合。 分子療法 在某些具體實施例中，尤其感興趣的是運動神經元、星形膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞、中樞神經系統中之大腦皮質之細胞、周邊神經系統中之感覺神經元、周邊神經系統中之神經膠細胞（例如許旺細胞）及其任何組合。
還提供了核酸、載體、封裝系統以及製造該腺相關病毒組成物的方法。 本文提供的rAAV組成物特別有利，在於它們可有效地編輯個體的細胞（例如肝細胞）基因體，以在肝臟特定啟動子的控制下表達PAH，從而提供PKU患者一種潛在的治癒機會。 分子療法 如請求項74至77中任一項之封裝系統，其中該第四核苷酸序列包含一或多種來自選自由以下組成之群組的病毒之基因：腺病毒、疱疹病毒、痘瘡病毒及細胞巨大病毒（CMV）。 一種用於治療患有異染性白質失養症（MLD）之個體之方法，該方法包含向該個體投與有效量之rAAV，該rAAV包含： （a）AAV衣殼，其包含衣殼蛋白質；及 （b）轉移基因組，其包含可操作地連接至以緘默方式改變之ARSA編碼序列之轉錄調節元件。
如請求項1至70中任一項之rAAV、如請求項71之醫藥組成物或如請求項72之多核苷酸，其用於治療患有PKU之個體的方法，該方法包含向該個體施用有效量之該rAAV、該醫藥組成物或該多核苷酸。 一種用於治療患有苯丙酮尿症之個體的方法，該方法包含向該個體施用有效量之如請求項1至70中任一項之rAAV、如請求項71之醫藥組成物或如請求項72之多核苷酸。 如請求項1至41中任一項之rAAV，其中該5’及3’同源臂核苷酸序列中的每個獨立地具有約100至約2000之核苷酸長度。
在PAH-006m-LP-1與游離轉基因表達載體皆觀察到在載體基因體複製物數目及mRNA兩者中之劑量反應。 PAH‑006m‑LP‑1（圖9F）載體複製物數目游離轉基因表達載體（圖9E）相比所有劑量皆較高。 分子療法 觀察到轉基因及整合載體之間VG/ug的差異，且可能反映自互補及單股載體之間穩定性差異。 已評估PAH-006m-LP-1載體在小鼠中減少血液Phe含量的能力，且與hPAH mRNA表達及在小鼠PAH基因座之靶插入有關。
兩個擴增子中的每一者共享其各自位於每個同源臂側翼之基因體DNA的外引子，而內引子分別對於未編輯等位基因或對於編輯的等位基因來說是獨特的。 野生型及編輯的序列的每個數目通過計數涵蓋同源臂及插入基因或未編輯野生型序列之任一者交界處的序列數目來統計。 藉由使用此NGS方法，可檢測到每個等位基因總數目的靶插入百分比，且另外，可以收集整個插入位點序列使得檢測到原發突變（例如不正確插入及缺失事件及ITR整合）。 在封裝系統之某些實施例中，輔助病毒選自由以下組成之群：腺病毒、疱疹病毒（包括單純疱疹病毒）、痘病毒（諸如牛痘病毒）、巨細胞病毒及桿狀病毒。 在封裝系統之某些實施例中，其中輔助病毒為腺病毒，腺病毒基因體包含一或多種選自由以下組成之群的腺病毒RNA基因：El、E2、E4及VA。 在封裝系統之某些實施例中，其中輔助病毒為HSV，HSV基因體包含選自由以下組成之群的HSV基因中之一或多者：UL5/8/52、ICPO、ICP4、ICP22及UL30/UL42。
經過43週，在第4及10週齡小鼠中觀察到血清Tyr濃度相應的增加（圖11C）。 圖11E顯示在第2、4及10週齡以小鼠設計載體處理之小鼠肝臟檢測到的載體基因體含量。 圖11I顯示在第2、4及10週齡以小鼠設計載體處理之小鼠肝臟檢測到的mRNA含量。 為了評估在PAHenu2小鼠中靶基因座整合的數量和保真度，進行兩個方法以檢測整合事件：ddPCR及次世代定序。 為了判定靶基因插入在整合位點是否伴隨新生突變，對橫跨左及右同源臂且進入靶插入位點的基因體序列的PCR擴增子進行定序。
圖 9E為顯示在投與單次靜脈內4e13 vg/kg之劑量的封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000之ARSA（-/-）小鼠之大腦中，以每微克基因組DNA計的載體基因組之數目之圖。 圖 9F為顯示在投與單次靜脈內4e13 vg/kg之劑量的封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5000之ARSA（-/-）小鼠之大腦中，以每奈克RNA計的ARSA轉錄物之複本之數目之圖。 發現在AAVHSC15與AAV9衣殼介導之遞送之間的比較中，AAVHSC15在腦部中顯著優於AAV9。
為了判定在人類肝臟中靶上插入及mRNA表達是否能達到類似含量，實驗在包含人類肝臟異種移植FRG小鼠中進行。 小鼠以單一IV劑量1E+14 vg/kg之封裝於AAVHSC15衣殼內之PAH-032h處理。 PAH-032h不包含肝特異性啟動子，因此表達由內源性人類啟動子元件驅動，類似於構築體PAH-006m。 此方法使用橫跨人類PAH編輯構築體之左及右整合位點的測定法，以用於計算靶插入。
如本文所用，術語「可操作地連接」用於描述TRE與待轉錄之編碼序列之間的連接。 通常，基因表現置於包含一或多個啟動子及/或增強子元件之TRE的控制下。 若編碼序列之轉錄受TRE控制或影響，則編碼序列「可操作地連接」至TRE。 TRE之啟動子及增強子元件可相對於編碼序列呈任何方向及/或距離，只要獲得所要轉錄活性即可。
在給藥後第28及29天處死接受單次靜脈內劑量之4e13 分子療法 vg/kg之封裝於AAVHSC15中之pHMI-5005之NHP（第2組動物）。 在經處死之第2組動物之中樞神經系統（CNS）及腦脊髓液（CSF）中偵測人類ARSA酶活性水準（圖17）。 如圖17中所示，偵測到高於治療閾值（野生型人類腦部含量之15%）之hARSA活性水準，如由虛線指示。 動物18C27（第2組）之CNS及周邊神經系統（PNS）中之免疫螢光染色證實存在hARSA（經由V5標籤偵測）且存在於包括背根神經節、脊椎運動神經元及小腦之特定區域中。 在另一態樣中，本發明提供用於在細胞中表現ARSA多肽之方法。 因此，在某些具體實施例中，本文中所揭示之方法涉及用如本文中所揭示之rAAV轉導細胞。