將表2所示的23種抗體與生物素標記的CD19蛋白混合後，加入到Jurkat-FMC63 scFv細胞培育1小時，DPBS洗一次，加入鏈黴親和素-APC培育30分鐘，DPBS洗一次後流式細胞儀上機檢測CD19蛋白結合。 本發明的抗體與標靶CD19的CAR-T結合，從而阻斷CAR-T的功能，抑制細胞激素風暴、神經毒性和其它CAR-T相關毒副作用的發生發展。 此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。
將表2所示的23種抗體加入到FMC63-CAR-T細胞，在不同時間點檢測FMC63-CAR-T細胞的密度和數量。 結果如圖6、7、8顯示，抗FMC63抗體可以促進FMC63-CAR-T細胞的增殖、活化和細胞激素釋放。 腫瘤放射治療 結果如圖4和表7所示，MSD檢測結果顯示抗FMC63抗體可以與FMC63-scFv按照劑量依賴的方式結合，說明抗FMC63抗體可以應用到MSD方法中。 FACS檢測方法如下：將mAb與Jurkat-FMC63 scFv細胞混合，室溫培育30分鐘後DPBS洗一次，加抗鼠Fc抗體室溫培育30分鐘，DPBS洗一次後流式細胞儀上機檢測。 透過ELISA/FACS篩選免疫有反應的小鼠，取小鼠脾臟淋巴細胞與Sp2/0-Ag14細胞融合獲得雜交瘤細胞，將雜交瘤細胞平盤培養至96孔培養盤中進行生長，10-14天後取上清用ELISA/FACS篩選細胞、解離速率常數，選擇高特異的亞選殖株進行擴大培養以及凍存。 在另一優選例中，所述經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸序列所形成的序列優選爲同源性或序列相同性爲至少80%，較佳地至少85%，更佳地至少爲90%，最佳地至少95%的胺基酸序列。
腫瘤放射治療: TW202144435A – 一種抗cd19抗體的抗體及其製備和應用
在本發明的第二十一方面，提供了一種製備人源化抗體的方法，包括步驟： 將本發明第一方面所述的重鏈可變區和/或本發明第三方面所述的輕鏈可變區中的CDR區的核苷酸序列植入含人源抗體FR區的核苷酸序列模板，再將其選殖入含有人抗體恆定區的表現載體後，透過轉染動物細胞表現人源化抗體。 在本發明的第二十方面，提供了一種製備嵌合抗體的方法，包括步驟： 將本發明第一方面所述的重鏈可變區和/或本發明第三方面所述的輕鏈可變區的核苷酸序列選殖入含有人抗體恆定區的核苷酸序列的表現載體後，透過轉染動物細胞表現人-鼠嵌合抗體。 在優選例中，所述的組成物是藥物組成物，它含有上述的抗體或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相應的免疫細胞，以及藥學上可接受的載劑。
在另一優選例中，所述添加、缺失、修飾和/或取代的胺基酸數量爲1-7個，較佳地爲1-3個，更佳地爲1個。 結果顯示，mAb06 、mAb023 在ELISA檢測中效果最優，mAb020 在FACS中檢測中效果最優。
腫瘤放射治療: TW202144435A – 一種抗cd19抗體的抗體及其製備和應用
將FMC63-scFv-mFc(FMC63抗體的一條鏈)的核苷酸序列併入到真核細胞表現載體中，使用PEI將攜帶FMC63核苷酸的表現載體轉入293細胞中，使其表現FMC63蛋白，使用protein A管柱純化得到FMC63蛋白(FMC63-scFv-mFc蛋白)。 一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。 這通常是將其選殖入載體，再轉入細胞，然後透過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。 本發明中，所述抗體爲抗CD19抗體的抗體，所述的CD19抗體包括FMC63及其衍生序列。 腫瘤放射治療 本發明的抗體包括重鏈和輕鏈，所述重鏈含有重鏈可變區胺基酸序列，所述輕鏈含有輕鏈可變區胺基酸序列。
- 每條輕鏈的一端有可變區，另一端有恆定區；輕鏈的恆定區與重鏈的第一個恆定區相對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區相對。
- 恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現出不同的效應功能，例如參與抗體的依賴於抗體的細胞毒性。
- 在另一優選例中，所述添加、缺失、修飾和/或取代的胺基酸數量，不超過初始胺基酸序列總胺基酸數量的40%，較佳地爲20%，更佳地爲10%。
- 本發明的第八方面，提供了一種重組的免疫細胞，所述的免疫細胞表現外源的如本發明第七方面所述的CAR建構物。
- 在另一優選例中，所述CD19相關疾病選自下組：癌症、自體免疫疾病、代謝相關疾病、感染疾病、或其組合。
- 選取單選殖株細胞mAb02、mAb06、mAb07、mAb020 、mAb023進行DNA定序，定序後得到的抗體重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列如表6所示，表6還顯示了抗體定序分析後得到的CDR區。
本發明的單株抗體能夠高特異性地結合CD19抗體並阻斷CD19抗體的功能。 如請求項10所述的用途，其特徵在於，所述的藥物用於中和CD19抗體或用於封阻在細胞上表現的標靶CD19的CAR。 一種CAR建構物，其特徵在於，所述的CAR建構物的抗原結合結構域包含如請求項1所述的重鏈可變區和如請求項3所述的輕鏈可變區，較佳地，所述嵌合抗原受體構成還包含：樞紐區、跨膜區、共刺激信號區和CD3z。 一種抗體，其特徵在於，所述抗體具有： 如請求項1所述的重鏈可變區；和/或 如請求項3所述的輕鏈可變區； 或者，所述抗體具有：如請求項2所述的重鏈；和/或如請求項4所述的輕鏈。 將表2所示的23種抗體與FMC63-CAR-T細胞共培育1小時，將培育後的FMC63-CAR-T細胞添加到鋪有Hela-CD19的RTCA培養盤中，觀察與抗體結合後的CAR-T對標的細胞的毒殺功能變化，從而篩選得到可以阻斷FMC63-CAR-T功能的抗體。
腫瘤放射治療: TW202144435A – 一種抗cd19抗體的抗體及其製備和應用
利用FMC63設計的CAR-T細胞藥物已經成功上市，在治療B-ALL和NHL上有較好的療效。 應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。 在另一優選例中，所述的載體包括：細菌質體、噬菌體、酵母質體、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒、或其他載體。 在另一優選例中，所述的CD19高度表現的腫瘤指腫瘤組織中CD19轉錄本和/或蛋白的位準L1與正常組織中轉錄本和/或蛋白的位準L0之比，L1/L0≥2，較佳地≥3。 腫瘤放射治療 細胞激素風暴是指在對人體完成CAR-T輸液後，T淋巴細胞在體內被活化並快速增殖，引起了TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12等細胞激素過度的級聯釋放。 這些細胞激素會媒介多種免疫反應，引起患者高燒、低血壓、肌痛、凝血障礙、呼吸困難、終末器官障礙等臨床表現，有可能對人體的組織器官造成嚴重的永久性損傷或衰竭，甚至導致死亡。
本發明中，所採用的樣本(樣品)包括細胞、組織樣本和活體組織切片標本。 本發明使用的術語“活體組織切片”應包括本領域技術人員已知的所有種類的活體組織切片。 因此本發明中使用的活體組織切片可以包括例如腫瘤的切除樣本、透過內窺鏡方法或器官的穿刺或針刺活體組織切片製備的組織樣本。 抗體上某些殘基(如Cys或Lys等)用於與多種功能基團相連，其中包括成像試劑(例如發色基團和螢光基團)，診斷試劑(例如MRI對比劑和放射性同位素)，穩定劑(例如乙二醇聚合物)和治療劑。
腫瘤放射治療: TW202144435A – 一種抗cd19抗體的抗體及其製備和應用
功能劑(例如藥物，檢測試劑，穩定劑)被偶聯(共價連接)至抗體上。 本發明的第十六方面，提供了一種檢測盤，所述的檢測盤包括：基板(支撑盤)和測試條，所述的測試條含有本發明第五方面所述的抗體或本發明第九方面所述的免疫偶聯物。 在本發明的第五方面，提供了一種抗體，所述抗體具有： 本發明第一方面所述的重鏈可變區；和/或 本發明第三方面所述的輕鏈可變區； 或者，所述抗體具有：本發明第二方面所述的重鏈；和/或本發明第四方面所述的輕鏈。 CD19是簇分化抗原的一種，是B細胞增殖、分化、活化及抗體產生有關的重要膜抗原。 腫瘤放射治療 絕大多數的B細胞性惡性腫瘤表面都高度表現CD19，多個中心獨立開展的利用嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor，CAR)修飾的T細胞標靶表現CD19的B細胞復發、難治性惡性腫瘤取得了前所未有的成功。
通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載劑介質中，其中pH通常約爲5-8，較佳地pH約爲6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。 如本文所用，術語“可變”表示抗體中可變區的某些部分在序列上有所不同，它形成了各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。 它集中於輕鏈和重鏈可變區中稱爲互補决定區或超變區中的三個片段中。 天然重鏈和輕鏈的可變區中各自包含四個FR區，它們大致上呈β-折疊構型，由形成連接環的三個CDR相連，在某些情况下可形成部分β折疊結構。 每條鏈中的CDR透過FR區緊密地靠在一起並與另一鏈的CDR一起形成了抗體的抗原結合部位。
腫瘤放射治療: TW202144435A – 一種抗cd19抗體的抗體及其製備和應用
以CAR-T爲首的免疫療法給無數患者帶來了“治癒癌症”的希望，但CAR-T在具有突出有效性的同時，也有著一個亟待解决的問題，那就是嚴重的副作用——細胞激素風暴。 本發明的藥物組成物可直接用於結合CD19抗體或標靶CD19的CAR-T細胞，因而可用於輔助治療腫瘤等疾病。 本發明所述抗體也可以是由核苷酸序列在細胞內表現用於細胞治療，比如，所述抗體用於嵌合抗原受體T細胞免疫療法(CAR-T)等。 配製好的藥物組成物可以透過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)：瘤內、腹膜內、靜脈內、或局部給藥。