在一具體實施例中，該CAR+/mPSCOct-4_hi為一肺癌起始細胞。 過量表現Oct-4之CAR+/mPSC代表在CAR+/mPSC中的Oct-4表現量高於正常細胞10倍。 在一較佳具體實施例中，CAR+/mPSC中的Oct-4表現量高於正常細胞16倍，在一更佳實施例中，CAR+/mPSC中的Oct-4表現量高於正常細胞20倍。
然，由第3B圖可知，加2.5mg/kg之藥(該喹唑啉酮衍生物)的組別與沒加藥(Control組)的組別相比，2.5mg/kg的組別在第14天(第7次加藥)就可觀察到腫瘤大小比起沒加藥(Control組)的組別已有明顯變小，並在第50天結束觀察時比起沒有加藥的組別小了約30%。 而，5mg/kg的組別則在第12天(第6次加藥)就可觀察到腫瘤大小與沒加藥組別相比已有明顯變小，並在第50天結束觀察時比起沒有加藥的組別小了約41.7%。 腫瘤形成 由此可知，該喹唑啉酮衍生物在小鼠體內可以有效的抑制該口腔鱗狀上皮癌細胞之腫瘤形成能力。
腫瘤形成: 正常の好酸球数
在一較佳具體實施例中，該表現量係指蛋白質的表現量，該蛋白質由Oct-4的基因編碼而得。 在一更佳具體實施例中，該Oct-4基因之序列為SEQ ID NO：1。 「抗癌藥物(Anti-cancer drug)」是指包含具有抗腫瘤活性之活性成分的組合物，「抗腫瘤活性」係指一抑制腫瘤生長的效果，一腫瘤細胞毒性及/或腫瘤退化效果。 最後，請參閱第8圖，其係本發明之喹唑啉酮衍生物與5-氟尿嘧啶組合之實驗結果圖。 其組合係使用藥物合併指數由周廷潮以及塔氏在1984年所提出，利用CompuSyn電腦軟體輸入各個藥物單獨使用以及合併使用後之藥效，經由Chou-Talalay Plot之計算測定藥物的協同或拮抗作用。 根據Soriano等的判斷方法，CI＞1.1為拮抗作用，0.9≤CI≤1.1為疊加作用，CI＜0.9為協同作用。
將細胞懸浮於含有BODIPY-氨基乙醛(BODIPY-aminoacetaldehyde；BAAA)的ALDEFLUOR試驗緩衝劑於37℃下反應60分鐘。 細胞以一種乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)抑制劑(二乙基氨基苯甲酮(diethylaminobenzaldehyde；DEAB))處理並作為陰性對照組。 螢光流式細胞分選測量儀藉由綠色螢光通道( nm)用於分析細胞之乙醛脫氫脢活性。
腫瘤形成: 正常の好酸球数
在一具體實施例中，偵測候選藥物於腫瘤組織的效果包含觀察癌起始細胞隨著時間的變化、癌症發展過程或是其於腫瘤組織內之生物特性。 本發明進一步包含一種確認候選藥物是否為抗癌藥物的步驟，其乃依據步驟中測試化合物抑制效果的結果。 其結果如第4圖，其係本發明之口腔癌細胞之細胞週期之實驗結果圖，在12小時的實驗中可以看到G2/M週期由原本的19.4%增加至38.0%。 顯示當該口腔鱗狀上皮癌細胞有加藥(該喹唑啉酮衍生物)處理時，有加藥之組別相較於正常組別，其週期中G2/M時期的停滯狀況皆有顯著上升的情況，本發明之該喹唑啉酮衍生物能使該口腔鱗狀上皮癌細胞停滯在G2/M時期，並使其走入細胞凋亡(如第5圖)。
- 此外，有些內皮細胞同時表現內皮細胞抗原且為GFP陽性(圖17-i,ii與iii)。
- 在另一具體實施例中，該CAR+/mPSCOct-4_hi具有癌細胞功能，其中該癌細胞功能包含細胞增生、細胞轉移、細胞侵襲或其組合。
- 因此，為了提高後期(第四期)口腔癌之治癒機會以及減少口腔癌之化療藥物的副作用，研發新的具有抗癌效果之藥物，為本技術領域人員所欲解決的問題。
- 與老鼠胚胎幹細胞株相比，CAR+/mPSCs於聚合酶連鎖反應及即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)分析中其Oct-4、Sox-2與Nanog表現量較低(圖1)。
- 為了確定GFP陽性之內皮細胞的出現，分離腫瘤並以流式細胞儀檢測，其結果與免疫螢光染色相似，12-18%之CD31+族群亦為GFP陽性(圖17)。
- 這些結果顯示CAR+/mPSCs經Oct-4高量表現後出現惡性轉變，其透過體內與體外之CAR+/mPSCsOct-4_hi細胞株致瘤潛能及腫瘤起始能力實驗皆可得到證實。
在一較佳具體實施例中，該Oct-4基因的序列為SEQ ID NO：1。 本文之「抗癌(anti-cancer)」一詞包含治療及抑制癌症。 本文之「治療」一詞包含治癒、痊癒、減緩、減輕、改變、補救、改善、改進或影響疾病、疾病之症狀或患病傾向。 治療及/或抑制癌起始細胞可以改善、預防、消除或減低個體的癌起始細胞的數量，或消除個體中的癌起始細胞等。 因此，為了提高後期(第四期)口腔癌之治癒機會以及減少口腔癌之化療藥物的副作用，研發新的具有抗癌效果之藥物，為本技術領域人員所欲解決的問題。
腫瘤形成: 正常の好酸球数
對CAR+/mPSCs及CAR+/mPSCs衍生之第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)藉由反轉錄病毒轉染使Oct-4過量表現。 表3顯示似鵝卵石之細胞群落形成的頻率，CAR+/mPSCs之轉染假控制組或CAR+/mPSCs衍生之第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)以Oct-4轉染皆無法觀察到群落形成。 端粒酶活性係利用端粒酶重複擴增(telomerase repeat amplification；TRAP)試驗測量，細胞於TRAP裂解緩衝液中均質化。 腫瘤形成 腫瘤形成 於3℃下反應30分鐘後，端粒酶延長產物經PCR於以下條件中放大：30個循環，每個循環包含94℃下30秒、60℃下30秒與72℃下45秒。 將反應混合物加熱至94℃ 5分鐘以將端粒酶去活性，放大之產物以12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，再以溴乙錠染色並在紫外光下觀察。 過量表現Oct-4之CAR+/mpSCs代表在每個CAR+/mPSCs中Oct-4表現量高於正常細胞10倍。
CAR+/mPSCs於第7天表現其分化為第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)之潛能， 其證據為其扁平細胞之型態以及第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)標記T1α與AQP5(圖1)的出現。 因此，CAR+/mPSCs具有肺部專一性幹細胞/先驅細胞(stem/progenitor cell)之特性，這些細胞可利用CAR表現來辨識及利用螢光流式細胞分選儀有效分離出來。 腫瘤切片於檸檬酸鹽緩衝液(10mM，pH 6.0)中經微波輻射修復抗原，將此腫瘤切片與初級抗體於4℃下反應過夜。 免疫組織化學染色係將此腫瘤切片與相對應之HRP-偶聯之二級抗體在室溫下反應一小時後，利用0.05%之3,3′-二氨基聯苯胺(3,3’-diaminobenzidine；DAB)以肉眼觀察，細胞核以蘇木精複染。
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雖然這些研究證實某些多能基因，如Oct-4、Sox-2及Nanog，與腫瘤起始特性密切相關，但異常多能基因的表現與癌起始細胞生成之間的關聯仍不明，有待進一步釐清。 癌起始細胞可利用不同的體外測定法和細胞標記物鑑定，如側群細胞分析、球體形成試驗、化療抗性、乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)活性及細胞標記CD133。 腫瘤形成 然而，單獨使用以上的體外測定法並無法證實所檢測細胞確實為癌起始細胞。 因此，特定的體內測定法，如動物模型之限制性稀釋移植實驗，被用來確認體外測定的結果。 癌起始細胞鑑定的不一致性可能起因於所 研究之細胞源自不同的癌細胞株或成熟腫瘤，臨床腫瘤樣本的表型或功能上的異質性可能加重癌起始細胞鑑定上的困難。 步驟如下：先將該口腔鱗狀上皮癌細胞以2×106顆種5盤在10公分細胞盤中，放入培養箱中24小時使細胞貼附。
其實驗步驟如同存活率實驗，但於加藥時，先加入該喹唑啉酮衍生物並在5分鐘內再加入5-氟尿嘧啶(5-Fu)。 如申請專利範圍第8項所述之癌起始細胞，其具有藉由活化ANG/Tie2訊息傳遞路徑以加強血管生成的功能。 如申請專利範圍第1項所述之癌起始細胞，其具有CD133表現、 乙醛脫氫酶(aldehyde 腫瘤形成 dehydrogenase；ALDH)活性、化療抗性或其組合。 在此所適當地舉例說明之發明，可能得以在缺乏任何要件，或許多要件、限制條件或並非特定為本文中所揭示的限制情況下實施。 所使用的名詞及表達是作為說明書之描述而非限制，同時並無意圖使用這類排除任何等同於所示及說明之特點或其部份之名詞及表達，但需認清的 是，在本發明的專利申請範圍內有可能出現各種不同的改變。
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蛋白質生存素已被充分證實能夠抑制細胞凋亡並在賦予癌起始細胞化療抗性中扮演重要的角色。 本發明發現生存素表現量在C1、E9與C7細胞株中明顯較CAR+/mPSCs高(圖11)。 C1、E9與C7細胞株在二氯二胺鉑與太平洋紫杉醇處理後亦較CAR+/mPSC展現較低表現量之裂解凋亡蛋白酶-3(cleaved caspase-3)與裂解凋亡蛋白酶-9(cleaved caspase-9)(圖11-ii)。 總括而言，這些結果顯示Oct-4之高量表現可以驅使CAR+/mPSCs轉型並賦予其似癌起始細胞的特性。
在異體移植腫瘤試驗中，50mg/公斤體重之Tie2抑制劑在C1細胞株移植7天後每2天經腹腔注射一次。 Tie2抑制劑顯著降低C1於腫瘤早期發展時期之腫瘤體積(圖19)。 因此，本發明提出之腫瘤血管形成機制可能不同於常規腫瘤血管形成機制，在CAR+/mPSCsOct-4_hi細胞株主動參與腫瘤血管新生的過程中Tie2/ANGs訊息傳遞扮演重要的角色。 本發明中，癌起始細胞在動物模型中生產，以深入了解癌起始細胞之性質與特性，這些發現可以幫助癌症研究以提供肺癌早期診斷與治療之洞悉。 本發 明可識別呈Oct-4陽性之肺部幹細胞/先驅細胞，且於體外證實其對SARS冠狀病毒(SARS-CoV)之感受性。 肺部幹細胞/先驅細胞分化為肺胞壁細胞，而血管新生係於三維明膠-微泡支架(3D gelatin–microbubble scaffold)中誘導。
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為了確定GFP陽性之內皮細胞的出現，分離腫瘤並以流式細胞儀檢測，其結果與免疫螢光染色相似，12-18%之CD31+族群亦為GFP陽性(圖17)。 為了檢查CAR+/mPSCsOct-4_hi細胞株與內皮細胞之間的關聯，利用即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)分析血管新生相關受體血管內皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2；VEGF2)與Tie2之基因表現。 專一性表現在內皮細胞之受體Tie2在內皮細胞生長培養基培養之C1、E9與C7細胞株中其表現皆顯著高於CAR+/mPSCs；而血管內皮生長因子受體2並無顯著差別(圖18)。 這些數據顯示CAR+/mPSCsOct-4_hi主動參與腫瘤血管新生，而非如CAR+/mPSCs扮演被動的角色。 另外，Tie2激酶抑制劑降低內皮細胞生長培養基培養之C1細胞株的管柱形成潛能，並於雞胚胎尿絨毛膜(chick chorioallantoic membrane；CAM)試驗中抑制C1細胞株促進的血管形成(圖19)。 另外，內皮細胞生長培養基培養之C1細胞株的管柱形成在抗體中和血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A；VEGFA)組與IgG控制組中並無顯著差異(圖19)。
在另一具體實施例中，該CAR+/mPSCOct-4_hi具有癌細胞功能，其中該癌細胞功能包含細胞增生、細胞轉移、細胞侵襲或其組合。 在另一具體實施例中，該CAR+/mPSC包含一載體，其中該載體包含一種能編碼Oct-4基因的核酸序列。 在一較佳具體實施例中，該Oct-4基因之序列為SEQ ID NO：1。 腫瘤形成 肺癌是全世界癌症相關死亡的主因之一，且五年整體存活率依然小於14%。 越來越多的證據顯示癌幹細胞，亦稱為癌起始細胞(cancer initiating cells；CICs)在腫瘤生長與傳統化療抗性中扮演關鍵的角色，且可能導致癌症轉移及復發。 惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，並非用來限定本發明實施之範圍，舉凡依本發明申請專利範圍所述之形狀、構造、特徵及精神所為之均等變化與修飾，均應包括於本發明之申請專利範圍內。
腫瘤形成: 正常の好酸球数
圖16顯示以內皮細胞生長培養基培養之CAR+/mPSCsOct-4_hi表現內皮細胞的表面標記，CAR+/mPSCsOct-4_hi C1、E9、C7細胞株於內皮細胞生長培養基中培育7天，接著分析其內皮細胞專一性表面標記之表現，其包括CD31、CD105、CD34及CD144，數字表示陽性表現族群。 在一具體實施例中，本發明進一步包含一步驟後的步驟，是為步驟，其為測試候選藥物對於癌起始細胞之細胞毒 性。 若該候選藥物對於癌起始細胞具顯著毒性，則該候選藥物是一種抗癌藥物或是治療癌起始細胞之藥物。 固態腫瘤被認為起因於含有幹細胞族群之器官，這些器官的腫瘤包括癌細胞之異質族群，其增生與形成新腫瘤的能力顯著不同；已報導指出此腫瘤形成能力之差別，例如乳癌細胞及中樞神經系統之腫瘤。
- 在一較佳具體實施例中，於CAR+/mPSC中Oct-4之表現量高於正常細胞16倍。
- 並進一步搭配5-氟尿嘧啶(5-Fu)使用，使抑制該口腔鱗狀上皮癌細胞可達到更好的效果。
- 圖16顯示以內皮細胞生長培養基培養之CAR+/mPSCsOct-4_hi表現內皮細胞的表面標記，CAR+/mPSCsOct-4_hi C1、E9、C7細胞株於內皮細胞生長培養基中培育7天，接著分析其內皮細胞專一性表面標記之表現，其包括CD31、CD105、CD34及CD144，數字表示陽性表現族群。
- 為以 免疫螢光染色呈現在C1、E9與C7細胞株之細胞膜中的CAR表現量，在Alex488nm螢光下標記CAR，DAPI為細胞核之標記，插入之圖像為正方形區域內之放大圖。
- 本發明提供一實施例，其內容在於喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，其中該口腔癌細胞係一口腔鱗狀上皮癌細胞。
- 放入培養箱中培養隔夜以利細胞貼附後，移除上清液，再以1×PBS清洗兩次並且移除後，分別依據組別加入所需的藥物(該喹唑啉酮衍生物)濃度，再放入培養箱中培養6以及12小時。
A549是癌細胞，但不是癌起始細胞；與A549細胞相比，CAR+/mPSCsOct-4_hi之軟瓊脂細胞群落形成、球體形成、CD133及乙醛脫氫酶活性皆有較高之表現量。 此外，少量之CAR+/mPSCsOct-4_hi(103顆細胞)即可形成腫瘤並具有腫瘤再生能力。 在CD133表現分析中，細胞被分離為單一細胞，清洗並懸浮於磷酸鹽緩衝液中。 細胞以別藻藍蛋白(allophycocyanin；APC)共軛抗老鼠CD133抗體標記，接著以螢光流式細胞分選測量儀分析。
腫瘤形成: 正常の好酸球数
此外，CAR+/mPSCsOct-4_hi表現內皮細胞標誌，包括CD31、CD105、CD34及CD144。 此外， CAR+/mPSCsOct-4_hi主動參與腫瘤血管形成、活化ANGs/Tie2訊息途徑；這些發現提供癌起始細胞可能起源與生成之新穎見解，並有助於闡明藉由癌起始細胞所負責介導之血管形成之途徑、提供肺癌之抗血管生成治療的新策略。 癌起始細胞及其用途 本發明係關於一種癌起始細胞，其包含過量表現Oct-4之分離的克沙奇病毒及腺病毒受體陽性之老鼠肺部幹細胞/先驅細胞與其用途。 一種喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，其中該喹唑啉酮衍生物係用於抑制一口腔癌細胞，該喹唑啉酮衍生物具有如下結構式： 。 由此可證實當該口腔鱗狀上皮癌細胞中加入該喹唑啉酮衍生物作用時，隨著該喹唑啉酮衍生物之濃度增加以及加入該喹唑啉酮衍生物處理的時間增加會促進該口腔鱗狀上皮癌細胞之凋亡的現象增加。 並由第3A圖可知，3組小鼠平均體重變化百分比並未有差異，表示該喹唑啉酮衍生物在進入小鼠體內後並未有顯著毒性。
腫瘤形成: 正常の好酸球数
在一較佳具體實施例中，該表現量係指蛋白質的表現量，該蛋白質是由一Oct-4的基因編碼而得。 在一更佳具體實施例中，Oct-4基因之序列為SEQ ID NO：1。 在另一具體實施例中，該CAR+/mPSCOct-4_hi表現內皮細胞之表面標記，其中該內皮細胞之表面標記包含CD31、CD105、CD34、CD144或其組合。 針對肺部癌起始細胞，已有不同的生物標識被提出，包含CD133的表現、乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)活性及化療 抗性。 在一具體實施例中，CAR+/mPSCOct-4_hi表現CD133、乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)活性、化療抗性及其組合。 該化療抗性意指CAR+/mPSCOct-4_hi對於化學放射治療或化療藥具有抗性。
腫瘤形成: 正常の好酸球数
在一較佳具體實施例中，每個 CAR+/mPSC的Oct-4表現量高於正常細胞16倍。 在一更佳具體實施例中，每個CAR+/mPSC的Oct-4表現量高於正常細胞20倍。 在一較佳實施例中，該表現量是指一DNA、RNA或蛋白質的表現量，該蛋白質是由Oct-4的基因編碼而得。 在一更佳具體實施例中，Oct-4基因之序列為SEQ ID NO：1，在另一具體實施例中，Oct-4基因為Oct-4的cDNA。
為利用免疫螢光染色C1-GFP細胞株衍生腫瘤所測得之內皮細胞抗原表現結果。 放大圖像顯示某些GFP陽性細胞參與血管形成(以箭號標示)，且一部分的GFP陽性細胞亦表現CD31(以星號標示)(比例尺：100μm)。 為以流式細胞儀分析C1-GFP細胞株之分離腫瘤的CD31表現，代表內皮細胞之CD31陽性子群占所有腫瘤族群之3%，在18%的CD31陽性內皮細胞子群中發現GFP表現。 如申請專利範圍第2項所述之喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，其中該喹唑啉酮衍生物係提升該口腔鱗狀上皮癌細胞之染色體變異。 如申請專利範圍第2項所述之喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，其中該喹唑啉酮衍生物係提升該口腔鱗狀上皮癌細胞之促凋亡蛋白之表現。 如申請專利範圍第2項所述之喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，其中該喹唑啉酮衍生物係抑制該口腔鱗狀上皮癌細胞之週期。
這也間接發現了口腔癌與現代人之生活環境及習慣息息相關，根據統計，高達70%以上罹患口腔癌之病患具有抽菸或嚼食檳榔的習慣。 利用TRIzol試劑萃取總RNA，依照製造商的說明使用M-MLV 腫瘤形成 RT合成cDNA。 即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)係利用7900HT即時聚合酶連鎖反應儀器操作，引子序列列於表1中，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase；GAPDH)表現用於標準化。