在一些實施例中，肽螯合劑藉由酶促或化學水解有機蛋白質製備。 在一些實施例中，稻米蛋白質分離物包括與經認證有機或可認證有機螯合劑結合之重金屬。 在一些實施例中，經認證有機或可認證有機螯合劑為肽螯合劑或檸檬酸。 在一些實施例中，蛋白質分離物為生成營養補充劑時之中間產物。
- 圖4A為聚丙烯醯胺凝膠電泳(「PAGE」)肽分離凝膠(庫馬斯藍染色)之影像。
- 以DMEM(2% FBS)對草藥萃取物(1.0 g/20 mL H 2O)及靈芝萃取物(0.25 mg/mL)進行2倍連續稀釋後，再用於篩選。
- 或者，當由本領域中具有一般知識者考量時，用語「約」是指在可接受的平均值標準誤差之內。
- 該方法包含對一患有SARS-CoV-2的個體投予一有效量藥劑，該藥劑選自由抗病毒劑、抗腫瘤劑、抗寄生蟲劑、離子通道調節劑、抗生素、草藥萃取物、蘇活茶、亮蓋靈芝的靈芝多醣區分部分3及其組合所構成的群組，以緩和或減低與SARS-CoV-2感染相關的症狀。
- 在某些例子中，該等藥劑被包裹在一脂質體中以避免其降解，並透過個體的循環系統來協助輸送該等藥物，及/或穿越細胞膜到達其所欲之細胞的標的位點。
在一些實施例中，在暴露於水解條件期間，蛋白質暴露於酶。 在一些實施例中，在收集肽螯合劑期間，過濾肽螯合劑以基於尺寸及/或分子量分離肽螯合劑。 在一些實施例中，藉由本文所揭示之方法製備之肽螯合劑在約21 kD至約19 kD、約16 kD至約14 kD、約13.5 kD至約12.5 kD、約11.5 kD至約10.5 kD及/或約4 kD至約2 kD分子量範圍處具有根據PAGE凝膠之顯性帶(例如峰)。 在一些實施例中，藉由本文所揭示之方法製備之肽螯合劑在約20.5 kD、約15 kD及/或約12.7 kD中之一或多者處具有其顯性PAGE帶及/或峰。
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總之，表3結果顯示該等化合物的組合適用於以動物模型進行進一步評估。 錠劑可以透過習知手段製造，例如壓製或模製，視需求決定而具有一或多種輔助成分。 模製的錠劑可以透過在合適的機器中，用被惰性液態稀釋劑濕潤的該粉狀化合物混合後，以模鑄的方式來製備。
根據本揭露內容的實施例，該藥劑係選自由草藥萃取物、蘇活茶、亮蓋靈芝的RF3、及其組合所構成的群組中，且被以0.01-5g/Kg的量投予至該個體。 根據本揭露內容的較佳實施例，適合用在本方法的草藥萃取物為一植物之水萃取物，該植物選自由唇形科、薄荷科、菊科、山茶科、豆科、菊科、三白草科、無患子科及忍冬科所構成的群組。 芡歐鼠尾草 本揭露內容乃基於意外發現部分已知的化合物與草藥萃取物於活體外或活體內均可有效抑制SARS-CoV-2的活性，因此，該等化合物與草藥萃取物為潛在可開發成用於治療SARS-CoV-2感染藥品的候選物。 在濃縮及分離蔬菜及植物產品時，通常分離及濃縮大體積量之材料以獲得最終產物。 在此分離方法期間，僅以大體積量源之少量存在的重金屬可變得更加濃縮且可達到不可接受高濃度。 當以SARS-CoV-2之一品系感染Vero E6細胞時，透過視覺下細胞病變作用(cytopathic effect，CPE)的程度來評估任一候選化合物於10 μM、3.3 μM及1 μM(或對強效化合物由1 nM到100 nM範圍) 濃度下的抗病毒能力。
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於第0天，以舒泰50(5 mg/kg)進行腹膜內麻醉，再以包含1×10 5TCID50之SARS-CoV-2的100 μL磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline，PBS)或是100 μL PBS進行鼻內滴注，以測試模擬感染之倉鼠。 在本研究期間每日監測倉鼠的體重與臨床表徵以度量疾病進程。 一天兩次透過口服投予治療群組，美爾奎寧、奈非那韋、沙利黴素或硫鳥嘌呤之任一(30 mg/kg/day)、紫蘇葉(200 mg/kg/day)、薄荷(200 mg/kg/day)或是亮蓋靈芝之萃取物(30 mg/kg/day)，同時給予對照群組相同體積的飲水。
如請求項21所述之用途，其中該紫蘇葉、該薄荷、該夏枯草乾燥果穗、該魚腥草、該黃花蒿及該甘草在組合中分別以40-75%、10-30%、0.1-2%、1-4%、5-15%及5-15%重量百分比或體積百分比的量存在。 如請求項10所述之用途，其中該蘇活茶為紫蘇葉、薄荷、夏枯草乾燥果穗、魚腥草、黃花蒿及甘草之組合的一水萃取物。 如請求項10所述之用途，其中該草藥萃取物為唇形科、薄荷科、菊科、山茶科、豆科、菊科、三白草科、無患子科及忍冬科之任何一植物的一水萃取物。 比較研究兩種蘇活茶製劑(製劑#1與製劑#2)對抗SARS-CoV-2的功效，其中感染SARS-CoV-2的小鼠以製劑#1與#2治療6天，然後測定肺部病毒效價。 結果發現蘇活茶製劑#2賦予了較製劑#1更佳的保護效果。 在本實施例中，對曾接觸過SARS-CoV-2病毒的倉鼠給予根據「材料與方法」段落記載所製備而成的蘇活茶，作為其飲用水，並測定體重、肺部病毒效價的變化。
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在感染後第3天，將倉鼠全部犧牲，並收集每隻倉鼠的肺部組織，透過在Vero E6細胞之TCID50測定測量活病毒載量。 以DMSO將來自上述化合物文庫之任一選定化合物配製成1 mM溶液後，將其轉移到96孔盤內。 每一化合物以DMEM(2% FBS)稀釋到最終濃度為10、3.3或1 μM(或者對強效化合物採更低的濃度)，以進行篩選。
用語「投予(administered、administering或administration)」於此是指一種輸送形式，其包括但不限於，靜脈內、肌肉內、腹膜內、動脈內、顱內或皮下投予本發明的一藥劑(例如一化合物或一組合物)。 在某些實施例中，本揭露內容的化合物或其鹽、溶劑合物是被配製成用於口服的錠劑。 芡歐鼠尾草 在其他實施例中，本揭露內容的化合物或其鹽、溶劑合物，在使用前，例如靜脈注射前，是被配製成粉末而與合適的載體(例如緩衝溶液)混合後再施用。
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在一些實施例中，所述方法產生肽螯合劑，其包括一或多種具有選自約21 kD至約19 kD、約16 kD至約14 kD、約13.5 kD至約12.5 kD、約11.5 kD至約10.5 kD及/或約4 kD至約2 kD之分子量範圍的肽。 在一些實施例中，所述方法產生肽螯合劑，其包括更多肽中之一者，所述肽包括選自約20.5 kD、約15 kD及/或約12.7 kD之分子量。 在一些實施例中，所述方法產生肽螯合劑，其包括更多肽中之一者，所述肽包括選自約20.5 kD、約15 kD、約12.7 kD及/或約11 kD之分子量。 圖1描繪量化各種稻米類型及來自各種源之稻米中金屬含量的資料。 圖2A提供在不同pH值下使用各種螯合劑或水自蛋白質混合物減少的重金屬總%的概觀。 圖2B描繪在pH 3下使用各種螯合劑或水自蛋白質混合物減少重金屬的結果。
在一些實施例中，經認證有機或可認證有機螯合劑為肽螯合劑、檸檬酸或其鹽。 在一些實施例中，巨量營養素分離物為碳水化合物分離物、脂肪分離物或蛋白質分離物。 在一些實施例中，食品源自白米、糙米、米糠、亞麻籽、椰子、南瓜、大麻、豌豆、芡歐鼠尾草、扁豆、蠶豆、馬鈴薯、向日葵、奎奴亞藜、莧菜、燕麥、小麥或其組合。 在一些實施例中，螯合劑為肽螯合劑，其中肽螯合劑藉由水解有機蛋白質製備。
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在一些實施例中，肽螯合劑之顯性帶及/或峰在約20.5 kD、約15 kD、約12.7 kD及/或約11 kD中之一或多者處。 在一些實施例中，所述方法包含步驟：將來自植物源之蛋白質暴露於水解條件一段時間，以製備蛋白質螯合劑。 在一些實施例中，所述方法包含步驟：自水解條件移出蛋白質螯合劑。 在一些實施例中，時間段小於或等於約1小時、約2小時、約4小時、約6小時，或包含及/或跨越前述值之範圍。
- 較佳地，該紫蘇葉、該薄荷、該夏枯草乾燥果穗、該魚腥草、該黃花蒿及該甘草在該組合中之體積百分比或重量百分比分別為40-75%、10-30%、0.1-2%、1-4%、5-15%及5-15%。
- 在一些實施例中，所述方法包括使螯合劑與重金屬結合，藉此形成錯合物。
- 如請求項23之肽螯合劑，其中所述更多肽中之一者包括選自約20.5 kD、約15 kD、約12.7 kD及約11 kD之分子量。
- 軌跡15為高及低分子量標準品兩者之組合，再次用於參考。
- 圖2H描繪在不同pH值下使用各種螯合劑或水自蛋白質混合物減少汞的結果。
- 根據本揭露內容的較佳實施例，該藥劑為以1：1之莫耳比率組合的奈非那韋與伊維菌素、以2：1之莫耳比率組合之頭花千金藤素與奈非那韋，或以2：1之莫耳比率組合之頭花千金藤素與伊維菌素。
然而，新療法的開發往往耗時數年；因此，重新利用或是重新定位現有藥物與草藥來治療COVID-19，已被認為是一種具有吸引力的方法。 如請求項23之肽螯合劑，其中所述一或多種肽具有選自約21 kD至約19 kD、約16 kD至約14 kD、約13.5 kD至約12.5 kD、約11.5 kD至約10.5 kD或約4 kD至約2 kD之分子量範圍。 如請求項20之方法，其中所述酶包括以下一或多者：酸內肽酶、鹼內肽酶、中性內肽酶、胃蛋白酶、木瓜酶、羧肽酶、彈性蛋白酶、Asp-N、Glu-C、Lys-C、Arg-C、蛋白酶K、枯草桿菌蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、麩胺醯基內肽酶或嗜熱菌蛋白酶。 如請求項1至5中任一項之方法，其中所述食品源自白米、糙米、米糠、亞麻籽、椰子、南瓜、大麻、豌豆、芡歐鼠尾草、扁豆、蠶豆、馬鈴薯、向日葵、奎奴亞藜、莧菜、燕麥、小麥或其組合。 如請求項23所述之用途，其中該紫蘇葉、該薄荷、該夏枯草乾燥果穗、該魚腥草、該忍冬、該款冬及該甘草在組合中分別以40-75%、10-30%、0.1-2%、1-4%、1-10%、1-10%及5-15%重量百分比或體積百分比的量存在。 如請求項10所述之用途，其中該蘇活茶為紫蘇葉、薄荷、夏枯草乾燥果穗、魚腥草、忍冬、款冬及甘草之組合的一水萃取物。
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一種用於製備肽螯合劑之方法，所述方法包括： 酶促或化學水解有機蛋白質以形成有機肽螯合劑；及 收集所述肽螯合劑。 上文的實施例之記載僅以範例方式呈現，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可對其進行各種修飾。 上文的說明書、實施例及數據提供了對本發明的示例性實施例的結構和使用的完整描述。 儘管上文已描述本揭示內容中各樣的實施方式有一定程度的特性，或參照一或多個各別的實施方式，本發明所屬領域技術具有通常知識者仍能在不悖離本揭示內容精神及範圍情形下，對已揭示的實施方式進行眾多修改。 在此實施例中，根據「材料與方法」段落中記載的步驟，對實施例1中透過細胞試驗所鑑別出的藥物或草藥萃取物進行動物試驗。 尤其是，在雌性敘利亞倉鼠中對包含美爾奎寧、奈非那韋、沙利黴素與硫鳥嘌呤的四種藥物；以及對包含RF3、紫蘇與薄荷的三種活性草藥萃取物進行其病毒根除效率的評估。
在一些實施例中，所述方法包括自水解條件移出蛋白質螯合劑。 芡歐鼠尾草 在一些實施例中，水解條件下之時間段小於或等於約1小時、約2小時、約4小時、約6小時，或包含及/或跨越前述值之範圍。 在一些實施例中，在收集肽螯合劑期間，過濾肽螯合劑以基於尺寸及/或分子量收集肽螯合劑。
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如請求項23之肽螯合劑，其中所述更多肽中之一者包括選自約20.5 kD、約15 kD及約12.7 kD之分子量。 如請求項11所述之用途，其中唇形科之該植物為野薄荷、薄荷、裂葉荊芥、羅勒、紫蘇葉、紫蘇、夏枯草乾燥果穗、夏枯草、芡歐鼠尾草及迷迭香。 如請求項1所述之用途，其中該藥劑為以1：1之莫耳比組合的奈非那韋與伊維菌素、以2：1之莫耳比組合之頭花千金藤素與奈非那韋，或以2：1之莫耳比組合之頭花千金藤素與伊維菌素。 本實施方式也分別測定了奈非那韋、頭花千金藤素與伊維菌素，在不同劑量下單獨或合併使用來對抗SARS-CoV-2的效果。
在本研究中，針對已批准且經臨床評估過的2,855種獨特的化合物進行抗病毒活性篩選。 將該些化合物分別溶解於二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide，DMSO)中(濃度1 mM)，且轉移到96孔微量滴定板來進行防制SARS-CoV-2介導之細胞病變效果的抗病毒活性測定。 適用於本方法之抗病毒劑的例子包含，但不限於，奈非那韋(nelfinavir, N-Bn)、奈非那韋甲磺酸酯(、與巴色匹韋。 豆科植物的例子包含，但不限於，花生、甘草、光果甘草( Glycyrrhiza glabra L.)、脹果甘草及密花豆。 適用於本方法之抗病毒劑的例子包含，但不限於，奈非那韋(nelfinavir (N-Bn))、奈非那韋甲磺酸酯與巴色匹韋。
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最大量的肽(標註為圖4E中的帶1、2、3及4)具有約20.5 kD、約15 kD、約12.7 kD及約11 kD的分子量，如所示。 上述描述提供情境及實例，但不應解釋為限制由本說明書隨後之申請專利範圍，或在任何其他主張此說明書優先權的專利中的申請專利範圍覆蓋的本發明的範疇。 芡歐鼠尾草 在本說明書中之任何實施例中描述及/或說明之任何特徵、結構、組分、材料、步驟或方法可與本說明書中的任何其他實施例中描述及/或說明的任何特徵、結構、組分、材料、步驟或方法一起使用或替代其使用。 儘管已關於某些說明性實施例及用途描述本發明，但其他實施例及其他用途，包含未提供全部本文所闡述的特徵及優勢的實施例及用途，亦在本發明的範疇內。
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圖2C描繪在pH 6下使用各種螯合劑或水自蛋白質混合物減少重金屬的結果。 圖2D描繪在pH 9下使用各種螯合劑或水自蛋白質混合物減少重金屬的結果。 圖2E描繪在不同pH值下使用各種螯合劑或水自蛋白質混合物減少砷的結果。 圖2F描繪在不同pH值下使用各種螯合劑或水自蛋白質混合物減少鎘的結果。
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由此資料預期蛋白質分解成較低分子量肽片段將產生更多抓住及固持於重金屬離子上的分子，用於自稻米蛋白質分離物混合物移除重金屬離子。 最大量的肽(標註為圖4C中的帶1、2及3)具有約20.5 kD、約15 kD及約12.7 kD的分子量，如所示。 圖4D中之結果表明K-2稻米蛋白質水解產物(例如肽螯合劑)在溶液中含有至少範圍在約21 kD至約19 kD、約16 kD至約14 kD、約13.5 kD至約12.5 kD、約11.5 kD至約10.5 kD及約4 kD至約2 kD的帶。 最大量的肽(標註為圖4D中的帶1、2及3)具有約20.5 kD、約15 kD及約12.7 kD的分子量，如所示。 圖4E中之結果表明K-3稻米蛋白質水解產物(例如肽螯合劑)在溶液中含有至少範圍在約21 kD至約19 kD、約16 kD至約14 kD、約13.5 kD至約12.5 kD、約11.5 kD至約10.5 kD及約4 kD至約2 kD的帶。
該方法包含對該個體投予一有效劑量之一藥劑，該藥劑選自由抗病毒劑、抗腫瘤劑、抗寄生蟲劑、離子通道調節劑、抗生素、草藥萃取物、蘇活茶、亮蓋靈芝的靈芝多醣區分部分3及其組合所構成的群組，以緩和或減低與SARS-CoV-2感染相關的症狀。 據此，本揭露內容的第一態樣是提供一種治療SARS-CoV-2感染患者的方法。 該方法包含對該個體投予一有效劑量之藥劑，該藥劑選自由抗病毒劑、抗腫瘤劑、抗寄生蟲劑、離子通道調節劑、抗生素、草藥萃取物、蘇活茶、亮蓋靈芝的靈芝多醣區分部分3及其組合所構成的群組，以緩和或減低與SARS-CoV-2感染相關的症狀。
法匹拉韋，一種流行性感冒Rdrp的抑制劑，在俄羅斯、中國與印度已被批准用於治療COVID-19，但施用該藥物的病患必須要被嚴密地監測以避免不良事件；近來，在日本第三階段臨床試驗的結果呈現了一些正面效果。 已有報導指出羥氯奎寧，特別是與鋅補充劑聯用時，可展現出對抗RNA病毒的抗病毒活性，但由於缺乏顯著益處，臨床上已不再單獨使用羥氯奎寧治療COVID-19。 如請求項31之肽螯合劑，其中所述更多肽中之一者包括選自約20.5 kD、約15 kD、約12.7 kD及/或約11 kD之分子量。 如請求項31之肽螯合劑，其中所述更多肽中之一者包括選自約20.5 kD、約15 kD及/或約12.7 kD之分子量。 如請求項27之肽螯合劑，其中在收集所述肽螯合劑期間，過濾所述肽螯合劑以基於尺寸及/或分子量收集所述肽螯合劑。 如請求項23之肽螯合劑，其中所述更多肽中之一者包括選自約20.5 kD、約15 kD、約12.7 kD及約11 kD之分子量。
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組分、要素、特徵、動作或步驟可與所描述不同地配置或進行，且在各種實施例中可組合、合併、添加或省略組分、要素、特徵、動作或步驟。 本文所述之要素及組分之所有可能組合及子組合意欲包含於本發明中。 芡歐鼠尾草 總之，已揭示螯合劑之各種實施例及實例，及減少金屬之方法。 本發明除特定揭示之實施例及實例以外延伸至其他替代實施例及/或實施例之其他用途，以及其某些修改及等效者。 此外，本發明明確涵蓋所揭示實施例之各種特徵及態樣可與彼此組合或相互替代。
針對局部投予，可以使用在本領域中習知的多種皮膚學上可接受的惰性賦形劑。 典型的惰性賦形劑可以是，例如水、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、丙二醇、礦物油、硬脂醇和可產生凝膠之物質。 例如，若該製劑為意欲經口服投予，就可以在該製劑外上腸溶衣，以避免本發明之藥劑在酸性環境中降解或在到達個體腸道前被降解。 該製劑可進一步包含額外的成分，以協助輸送本發明的藥劑，到達其所欲之標的位點。 在某些例子中，該等藥劑被包裹在一脂質體中以避免其降解，並透過個體的循環系統來協助輸送該等藥物，及/或穿越細胞膜到達其所欲之細胞的標的位點。 為便利起見，在說明書、實施例以及所附申請專利範圍中所採用的某些術語被統整於此。
以DMEM(2% FBS)對草藥萃取物(1.0 g/20 mL H 2O)及靈芝萃取物(0.25 mg/mL)進行2倍連續稀釋後，再用於篩選。 在添加有10% FBS之DMEM中培養Vero E6細胞(1 × 10 4每孔)。 培養1天後，當細胞達到80-90%匯合度時，移除該培養基。 在三孔一組的每一培養孔中加入100 μL內含有待測化合物及2% FBS之DMEM溶液。 適用於口服投予(例如透過攝取)的製劑可以以離散單位存在，例如以膠囊、扁囊劑或錠劑，其每一個均包含一預定量的活性化合物；例如以粉劑或顆粒劑；例如以在水性或非水性液體中之溶液或懸浮液；或例如以水包油型液體乳劑或油包水型液體乳劑；例如以推注劑；例如以舐劑；或例如以糊劑。