或者，可通过包括针对胸腺嘧啶残基的补骨脂素部分和使用UV光交联来介导永久固定。 脸癌 本发明中，术语“阵列”指表面上一定模式的一种或多种核苷酸的空间上限定的排列。 该阵列可由表面上至少96、384、536、10000、48000或192000、786000、6000万个离散位置处存在的单个核苷酸组成。 这些阵列还可位于微量滴定板的底部上或平底微量离心管上。 本发明还涉及一种治疗癌性病症(优选上皮癌)的方法，所述方法包括向有此需要的对象给予有效量的能够降低分泌的hCGβ的水平的试剂。
此外，在这些细胞系中，对于CGB1/2qPCR检测到396bp的较低丰度高分子量产物(图2-B)。 脸癌 这些产物(81bp、229bp、396bp)经测序并与已知的CGBGenBank序列数据库比对。 直至最近，制备单个照相平版掩模的高成本表明制备高密度寡核苷酸阵列的方法仅可用于阵列的大规模生成而不可用于单个阵列的个体设计。
GreenMix试剂盒(塞默科学公司)的方案进行实时PCR。 NTC(无模板对照)含有完整的qPCR主混合物但不含cDNA模板。 Green 脸癌 Mix试剂盒(塞默科学公司)的方案进行实时PCR。 收集来自75cm2烧瓶上生长的融合细胞培养物的介质并通过游离hCGβ试验测试以估计分泌的蛋白质的量。 从烧瓶中在胰蛋白酶-EDTA释放后使用血球计数器估计细胞数目。 使用人膀胱癌细胞系RT112、SCaBER和T24；乳腺癌细胞系C2235和C2238；前列腺癌LN-CAP和PC-3。
然而，德州仪器公司的数字化微镜装置在阵列合成中的应用使具体化个体阵列更直接和廉价地。 DMD是一种芯片，其包含786000个微机械铝镜的阵列，各镜是单独可寻址的。 使用这些小型铝镜以特定方式照射并与光沉积化学联用，可生成寡核苷酸探针的阵列。 若干公司和实验室已实施该技术，特别是优创公司和尼布乐经公司。 用于制备、杂交和分析高密度阵列的完全一体的台式装置可将整个微阵列实验流水线化为一天内完成(例如Geniomone；Baum等)。
针对hCG的第三国际标准制备物(批次75/589；NIBSC)进行校正。 完整hCG试验的检测限值(最低标准)是0.75pg/l。 使用USA hCG参比服务内部完整hCG ELISA定量完整hCG浓度，其中利用McAb 2119和4001-POD的抗体组合。
胎盘对照组织也显示存在CGB、CGB5、7、8转录本。 标准化的平均交点值在癌细胞之间存在差异且显示CGB基因在所选癌细胞系中的不同表达水平。 脸癌 MultiNA系统上qPCR产物的分离确认存在具有经计算大小的预测的PCR产物(图2-B)。 CGB1、2基因的转录本仅发现于膀胱癌细胞系SCaBER和RT112和乳腺癌细胞系C2235中(图2-A)。 所有qPCR产物都通过MultiNA电泳分离，其中检测到231bp产物(预测是229bp产物)。
针对管家基因GAPDH的水平标准化CGB基因的转录水平并使用平均交点值相对于使用非靶shRNA对照载体(校正物)转导的细胞中的基因表达水平计算。 最终结果表达为相对于校正物基因表达(设为100％)的CGB表达中的差异百分比。 对于癌症存在非常少的确定性测试且通常仅使用细胞学确认诊断。 脸癌 细胞的取样仅在显示症状以后且此时通常癌症在治疗功效点以外发展。
最优选地，当230bp剪接变体的表达水平超过CGB3、CGB5、CGB7和/或CGB8的表达水平的倍数为2时，指示存在hCGβ分泌性癌性病症，如CMAhCGβ分泌性癌性病症。 在优选的实施方式中，检测的表达产物是核酸，优选mRNA。 可使用基于230bp转录本和CGB1和/或CGB2基因的其他理论转录本和来自其他CGB基因(即CGB3、CGB5、CGB7和CGB8)的转录本之间的大小和/或序列差异的方法来检测是否存在核酸。 这些方法包括逆转录酶PCR、定量PCR、杂交技术(如凝胶电泳或毛细管电泳后的印迹)和任何核酸测序方法。 本发明涉及筛选人组织或流体样品中以癌症(如膀胱癌)中较差预后为特征的基因(尤其是CGB2和CGB1)的表达变化的方法。
这些双链体组在靶标上不同但CGB2 siRNA双链体与CGB1显著地交叉杂交(100％)，且CGB8siRNA双链体与所有经典CGB基因都显著地交叉杂交(大于95％)(表5)。 使用生成小干扰RNA的基于慢病毒的shRNA来转导hCGβ分泌性癌细胞。 脸癌 在这些检查中使用靶向CGB基因的不同外显子区域的两种不同的shRNA基因特异性构建体。
本发明延伸至本说明书(包括任何所附的权利要求、摘要和附图)所公开特征的任一新型种类或任何新型组合，或者延伸至如此公开的任何方法或工艺步骤的任一新型种类或任何新型组合。 本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的所有特征和/或如此公开的任方法或工艺的所有步骤可以任何方式组合，除了其中至少一些此类特征和/或步骤相互排斥的组合。 16.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述样品选自血液、尿液、脑脊液、痰液、支气管灌洗液和唾液或组织样品。 2.如权利要求1所述的用途，其中，所述正向引物与所述CGB2和/或CGB1基因的外显子1/外显子2边界处的序列杂交。 除非另有说明，该说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中所公开的各特征可由具有相同、等同或类似目的替代性特征替换。 因此，除非另有说明，所公开的各特征仅仅是一系列等同或相似特征的一个示例。
- 针对对照达到的光学密度(设为100％)标准化数据并表达为细胞数目变化百分比。
- 或者，活性成分可用水包油乳膏基质或油包水基质配制为乳膏剂。
- 11.如权利要求5-9中任一项所述的方法，所述方法使用能够与所述CGB2和/或CGB1基因的核酸表达产物杂交的核酸探针。
- HCGβ异位表达于所有上皮癌症的约32％中且与较差预后、快速转移和早期死亡相关。
- 因此，CGB1和/或CGB2 mRNA检测是转移性和侵略性癌症表型的诊断。
- 存在CGB1和/或CGB2基因的表达产物指示分泌hCGβ的癌症。
- 图5显示通过基因特异性短发夹RNA慢病毒颗粒敲减人绒膜促性腺激素的影响。
因此，进行本发明时，本领域技术人员可使用合适的前体，其通过酶Dicer的作用被原位(体内)加工为合适和有效的siRNA分子。 在一些实施方式中，siRNA可靶向基因组DNA并阻止或干扰基因转录。 在另一个方面中，本发明提供了一种用于治疗癌性病症(优选上皮癌)的组合物，其包含能够降低分泌性hCGβ的水平的试剂。 该组合物可包含阻止hCGβ表达的试剂，例如siRNA分子。 或者，该组合物可包含结合分泌的hCGβ的试剂(如抗体)。
最近，其他关于乳腺癌、肺癌和肾癌的研究都显示CGB7以相对低水平表达，这与这些最初所声称的不一致。 通过特异性hCGβELISA测量是否存在分泌至培养基的游离hCGβ蛋白及其量。 在剩余的癌细胞系(T24、PC-3、LN-CAP、C2238)中，没有可用该方法在介质中检测到的hCGβ(小于0.5ng/106个细胞/24h)。 癌细胞系中CGB、CGB5、7、8 mRNA的表达发生变化但在大多数情况中小于胎盘中观察到的表达水平的1％。 根据针对DNA-500试剂盒(岛津公司)的生产商说明书通过微芯片电泳系统MCE202 MultiNA(岛津公司)来检测实时PCR产物。
例如，可通过离子电渗从贴片中递送活性成分，参见PharmaceuticalResearch,3,318。 适用于口服给药的药物制剂的形式可以是离散单元如胶囊剂或片剂；粉末剂或颗粒剂；水性或非水性液体中的溶液剂或混悬剂；可食用的泡沫剂或发泡剂；或水包油液体乳液或油包水液体乳液。 与目前可获得的平行程度相比(现有技术DNA测序仪上单个毛细管内的96桑格测序反应)，整个晶片高密度寡核苷酸阵列可具有分析6000万个反应的容量(例如参见网站)。 应理解，除上述特别提到的成分，这些制剂还可以包括与所检查制剂类型有关领域的其他常规药剂，例如，适宜于口服给药的制剂可以包括调味剂。
可能需要除去该“标签”或者情况可能是融合蛋白本身保留了有用的足够的抗原性。 例如，该过程中使用的酶(如连接酶或聚合酶)可接合固体表面。 CGB1和CGB2在本发明中称作基因而非假基因，原因在于，虽然迄今为止它们被认为是假基因，但已在本申请中显示这些基因是表达的。 脸癌 A.hCGβ-LHβ基因簇，显示CGB基因、LHB和SNAR的相对位置。 起始密码子–ATG1和ATG2对应于替代性开放阅读框。
在ANOVA或Friedman双向分析中使用StatsDirectTM(埃尔垂卡姆公司，英国柴郡)软件分析统计学显著性(数据未正常分配)。 One Solution细胞增殖试验试剂(普洛麦格公司)替换生长培养基并将细胞在37℃下在具有95％空气、5％CO2的潮湿的气氛中孵育1-4小时直至显色。 在ANOVA或Friedman双向分析中使用Stats DirectTM(埃尔垂卡姆公司，英国柴郡)软件分析统计学显著性(数据未正常分配)。 较低丰度高分子量qPCR产物(396bp–图2-B)对应于睾丸和胎盘中前述基因CGB1/2的剪接变体之一。 存在该剪接变体包括来自内含子1的额外166个碱基对(由MultiNA分离系统测得为165)。 该较大片段显示对应于CGB基因的内含子1核苷酸序列的预测纳入区域的碱基对。
- 最近，研究表明CGB1剪接变体在妊娠前三个月内受到某种程度的上调。
- 本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的所有特征和/或如此公开的任方法或工艺的所有步骤可以任何方式组合，除了其中至少一些此类特征和/或步骤相互排斥的组合。
- 这些抗体优选特异性结合前蛋白中存在但成熟的蛋白质中不存在的氨基酸序列。
特异性CGB基因沉默之前和之后的75cm2烧瓶中生长融合细胞培养物的介质经收获以用于hCGβ蛋白定量。 使用前文所述双位点FBT-11hCGβ酶免疫试验估计hCGβ浓度。 使用血球计数器估计培养后细胞数目并将其用于标准化蛋白质浓度(1×106个细胞)。 针对重组hCGβ(西格玛公司)(范围为50pg/l至0.5pg/l)的标准曲线校正试验，其已针对hCGβ的第一国际参比制备物(批次75/551；NIBSC公司，英国波特斯巴)校正。 使用USAhCG参比服务内部完整hCGELISA定量完整hCG浓度，其中利用McAb2119和4001-POD的抗体组合。
因此，例如，本发明包括包含一个或多个插入、缺失、取代等的蛋白质或多肽。 可通过检测CGB2和/或CGB1基因的表达产物来显示CGB2和/或CGB1基因的表达。 “表达产物”可以是核酸分子(如mRNA)或翻译自核酸序列的氨基酸序列(如肽、前蛋白或蛋白质)。 来自基因CGB1/2的mRNA在三种膀胱癌细胞系的两种中检测到；SCaBER和RT112显示与足月胎盘相比显著较高的转录本水平，两者都高128倍。 与胎盘对照样品相比，乳腺癌细胞系C2335显示高32倍的CGB1/2mRNA表达(参见表1)。 这里使用的标准品是重组hCGβ(西格玛公司)，其针对于hCGβ的第一国际参比制备物(NIBSC公司，英国波特斯巴)进行校正(浓度范围为0.5ng/ml至50ng/ml)。
图5显示通过基因特异性短发夹RNA慢病毒颗粒敲减人绒膜促性腺激素的影响。 使用靶构建体沉默后通过实时PCR测量mRNA的相对水平，通过ELISA估计培养基中hCGβ的量并通过MTS测量活细胞数目。 数据标准化至非靶shRNA转导的细胞所测得的水平(设为100％)。
诸如BLASTx的程序将比较类似序列的最长延伸体并为该匹配赋值。 因此可以获得其中发现若干类似区域的比较，其各自具有不同的评分。 该样品可以是血液、尿液、脑脊液、痰液、支气管灌洗液和唾液或组织样品。 组织样品包括活检材料、脱落细胞、循环的肿瘤细胞、刷取活检样品和通过拭子获得的细胞(例如鸡上皮细胞)和刷取活检样品(如宫颈刮片样品)。
在本发明的另一个方面中，提供了一种试剂盒，用于检测CGB1和/或CGB2基因/假基因或至少一种这些基因/假基因的产物的表达。 之前已表明人绒膜促性腺激素的特定基因及其亚基在具有其基因时是癌症的标志物(JM Bidart专利US 6,194,154)。 25.如权利要求24所述的试剂，所述能够降低分泌的hCGβ水平的试剂是降低一种或多种CGB基因表达的试剂。 21.一种治疗hCGβ分泌性癌性病症的方法，所述方法包括向有此需要的患者给予药学上可接受量的能够降低分泌的hCGβ水平的试剂。 18.一种用于检测和/或测量CGB2和/或CGB1基因的表达的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测和/或测量所述CGB2和/或CGB1基因的表达产物的试剂。
本发明中，表达和表达产物应理解为指天然mRNA转录产物及其衍生的cDNA，以及天然翻译产物(如前蛋白和蛋白质)。 CGB1和/或CGB2(主要是CGB2)的表达与癌症转移相关hCGβ蛋白(CMAhCGβ)的分泌特异性相关；而CGB基因(CGB3、CGB5、CGB7和CGB8 mRNA)的检测不相关。 因此，CGB1和/或CGB2 mRNA检测是转移性和侵略性癌症表型的诊断。 6.如权利要求5所述的方法，所述方法使用与所述CGB2和/或CGB1基因的外显子1内序列杂交的引物和/或与所述CGB2和/或CGB1基因中外显子2内起始位点之后序列杂交的反向引物。
SNAR-G位于基因CGB1和-2的外显子1的上游区域且显示为沿基因线较小黑色盒。 本发明的组合物可以采用任何合适的给药途径，例如通过口服(包括经颊或舌下)、直肠、鼻、局部(包括经颊、舌下或透皮)、阴道或胃肠道外(包括皮下、肌内、静脉内或皮内)途径。 这类制剂可通过药学领域已知的任何方法制备，例如通过将活性成分与运载体或赋形剂联系。 可通过出于最佳比较目的对齐序列(例如可在第一序列中导入缺口以进行序列的最佳比对)并比较相应位置处的氨基酸残基或核苷酸来测定两条核酸序列或两条氨基酸序列的相同性百分比。 通过比较的序列中相同氨基酸残基或核苷酸的数目来测定相同性百分比(即相同性百分比＝相同的位置数目/位置总数x100)。