當投予多次劑量時，該等劑量可彼此分開，例如分開一週、一個月、一年、或十年。 亦可將一或多種生長因子、荷爾蒙、介白素、細胞介素、或其他細胞在投予該等細胞之前、期間、或之後投予，以進一步使其等偏向特定細胞類型。 在某些實施例中，所生產之iPSC不會生產來自TCRG及TCRD基因座之聚合酶連鎖反應產物。 在某些實施例中，用於引入多能性相關基因之表現載體包括經修飾病毒多核苷酸（諸如來自腺病毒、仙台病毒、疱疹病毒、或反轉錄病毒），諸如慢病毒載體。
- 將2 mL的稀釋玻連蛋白溶液添加至6孔盤之各孔中。
- 「細胞培養基」（在本文中亦稱為「培養基(culture medium/medium)」或「培養物」）係用於培養細胞的培養基，其含有維持細胞活力及支持增生的營養素。
- 將盤在37℃下在含有5% CO 2之加濕培養箱中培養24小時。
- 如實施例D18或D19之方法，其中該一或多種重編程因子係選自由下列所組成之群組：OCT3/4、SOX2、KLF4、LIN28、及c-Myc。
- 如實施例A21或A22之方法，其中該滋養層包含小鼠胚胎纖維母細胞。
在某些實施例中，在步驟中經轉導γδ T細胞係於有絲分裂去活化之小鼠胚胎纖維母細胞存在下培養。 在某些實施例中，在步驟中經轉導γδ 副甲狀腺荷爾蒙 T細胞係於無滋養細胞條件下培養。 在某些實施例中，在步驟中經轉導γδ T細胞係培養於iMatrix-511塗佈盤中。
傳統上，排斥係藉由投予抗排斥藥物（諸如環孢素）來預防或減少。 然而，此類藥物具有明顯的不良副作用（例如，免疫抑制、致癌性質），且非常昂貴。 本發明應會消除（或至少大幅減少）對於抗排斥藥物（諸如環孢素、移護寧、FK-506、糖皮質素、及雷帕黴素、及其衍生物）之需要。
代表性FACS圖中之數字顯示在用Zol + IL-2 + IL-15刺激PBMC的第3天（左列）、第8天（中列）、及第13天（右列）時，TCR γδ及αβ T細胞在全PBMC中之頻率（上排）及TCRVγ9 +細胞在γδ T細胞中之頻率（下排）。 〔 圖2A 〕 至 〔 圖2B 〕顯示衍生自用Zol + IL-2 + IL-15刺激3天之PBMC培養物的iPSC群落之顯微鏡觀察。 圖 2A顯示代表性顯微鏡影像，其顯示在MEF滋養層上呈圓形群落之iPSC，該等群落具有緊密且平滑的邊界及緊實的細胞內部邊界。 背景中的細長細胞係經絲裂黴素C處理之MEF滋養層。
醫藥組成物一般包含治療有效量的至少一種所生產之iPSC或自其分化之細胞、及醫藥上可接受之載劑。 合適的醫藥上可接受之載劑包括但不限於抗氧化劑（例如，抗壞血酸）、保存劑（例如，苯甲醇、對羥苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸酯）、乳化劑、懸浮劑、分散劑、溶劑、緩衝劑、潤滑劑、填料、及/或稀釋劑。 可使用之典型緩衝劑包括但不限於醫藥上可接受之弱酸、弱鹼、或其混合物。 緩衝劑組分亦可包括水溶性試劑，諸如磷酸、酒石酸、琥珀酸、檸檬酸、乙酸、及其鹽。 在某些實施例中，該方法進一步包含將所生產之iPSC在體外或離體分化為所欲細胞類型。 在某些實施例中，該方法進一步包含將所生產之iPSC在體外分化為所欲細胞類型。
相比之下，生長在層黏蛋白-511塗佈盤（無滋養細胞之培養）上或與有絲分裂去活化T細胞耗竭之自體PBMC（基於滋養細胞之培養）共培養之經SeV轉導PBMC的實驗組（富集3天、8天、或13天）皆不會產出任何群落。 生長在MEF滋養層上的來自第8天PBMC培養物之經富集γδ T細胞亦不會產出任何群落。 經由細胞-細胞團塊富集來間接富集經活化γδ T細胞。
在不限制前述者下，一種特定滋養細胞類型可係人類滋養細胞，諸如人類皮膚纖維母細胞。 大致上，各種滋養細胞可部分用於維持多能性、將分化導向特定譜系、增強增生能力、及促進成熟為特化細胞類型（諸如效應細胞）。 第一內源多能性基因之表現指示cDNA會編碼活化內源多能性基因在體細胞中表現之基因。 在又另一具體實施例中，本文提供一種經單離誘導性多能幹細胞群，其包含表現一或多種重編程因子之多能細胞，其中該等多能細胞包含編碼TRG及TRD基因之重排的核苷酸序列，且其中該等重編程因子係Oct3/4、Sox2、Klf4、及c-Myc。 在另一具體實施例中，本文提供一種經單離誘導性多能幹細胞群，其包含表現一或多種重編程因子之多能細胞，其中該等多能細胞包含編碼TRG及TRD基因之重排的核苷酸序列，且其中該等重編程因子係Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、及Lin28。
使用寬孔吸管尖將管中之全部內容物轉移至經處理結合管柱中，以減少DNA在轉移過程中斷裂。 將純γδ T細胞群富集，且沒有任何αβ T細胞或其他細胞之汙染，只有來自在第8天及第13天的PBMC培養（與Zol+IL-2+IL-15培養）所採集的PBMC。 在室溫下將一小瓶的玻連蛋白(cat # A14700, Gibco)（在0.5 mg/mL之儲備液濃度下）解凍。 將60 µL玻連蛋白等分試樣製備於聚丙烯試管中。 這些等分試樣係立即使用或冷凍在-80℃下。 在5 mL聚苯乙烯圓底試管中，將沉降細胞團塊之細胞密度調整至1 mL的EasySep緩衝劑中有50 × 10 6個細胞。
例示性四環素類似物包括例如多西環素、氯四環素、及無水四環素。 在一些實施例中，經單離細胞群係衍生自容易取得且僅需要最低侵入程度之細胞類型，諸如纖維母細胞、皮膚細胞、臍帶血細胞、周邊血液細胞、及腎上皮細胞。 本揭露之經單離細胞群包括非為幹細胞、生殖細胞、或iPSC之任何身體T細胞。 非iPSC之非限制性實例係衍生自任何身體組織之T細胞，包括內部器官、皮膚、骨骼、血液、神經組織、及結締組織。
如實施例D14之方法，其中在該活化培養物中培養後，該經單離細胞群包含少於35% γδ 副甲狀腺荷爾蒙 T細胞。 如實施例D1至D15中任一者之方法，其中該等γδ T細胞之至少一部分經活化為Vγ9 +γδ T細胞。 如實施例D1至D15中任一者之方法，其中該等γδ T細胞之至少一部分經活化為Vγ9δ2 +γδ T細胞。 如實施例D1至D17中任一者之方法，其中用於執行將該等γδ T細胞重編程為多能狀態的功能之該步驟包含用編碼一或多種重編程因子之病毒載體轉導該等γδ T細胞；及在適用於將哺乳動物體細胞重編程為多能狀態之條件下培養經轉導之該等γδ T細胞。
如本文中所使用，「滋養細胞(feeder cell/feeder)」係描述一種類型之細胞的用語，其係與第二種類型之細胞共培養以提供第二種類型之細胞可生長、擴增、或分化的環境，因為滋養細胞提供用於支持第二種細胞類型之刺激、生長因子、及營養素。 滋養細胞可選地係來自與其等所支持之細胞不同的物種。 例如，某些類型的人類細胞（包括幹細胞）可由小鼠胚胎纖維母細胞、或永生化小鼠胚胎纖維母細胞之初代培養物支持。 在另一實例中，周邊血液衍生細胞或經轉化白血病細胞會支持自然殺手細胞之擴增及成熟。 滋養細胞在與其他細胞共培養時，一般可藉由幅照或用抗有絲分裂劑（諸如絲裂黴素）處理來去活化，以防止其等過度生長而超過其等所支持之細胞。 滋養細胞可包括內皮細胞、基質細胞（例如，上皮細胞或纖維母細胞）、及白血病細胞。
在某些實施例中，該方法進一步包含單離及/或純化所生產之iPSC。 在某些實施例中，該方法進一步包含向對象投予經單離之iPSC。 在某些實施例中，在步驟中γδ T細胞之至少一部分經活化為Vγ9 +γδ T細胞。 在某些實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養至多13天、至多10天、至多9天、至多8天、至多7天、至多6天、至多5天、至多4天、至多3天、至多2天、或至多1天。
在某些實施例中，在活化培養物中培養第一段時間後，經單離細胞群包含5%至75% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養第一段時間後，經單離細胞群包含5%至70% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養第一段時間後，經單離細胞群包含5%至65% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養第一段時間後，經單離細胞群包含5%至60% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養第一段時間後，經單離細胞群包含5%至55% γδ T細胞。
在一些實施例中，本文中所述之所生產之iPSC或包含所生產之iPSC的醫藥組成物係用於治療實體腫瘤。 實體腫瘤係組織之異常團塊，其通常不含有囊腫或液態區域。 不同類型的實體腫瘤係針對形成其等之細胞類型而命名（諸如肉瘤、上皮癌、及淋巴瘤）。 此外，如果必要，亦可以使用當前所屬技術領域中已知之其中一種負向選擇系統以自患者中消除治療性細胞。 例如，用胸苷激酶基因轉染之供體細胞將導致含有TK基因之胚胎細胞的生產。
在某些實施例中，在活化培養物中培養後，經單離細胞群包含5%至15% γδ T細胞。 用於製造多能幹細胞之材料及方法 本文特別提供生產誘導性多能幹細胞之方法及經單離之所生產誘導性多能幹細胞群、及其用途。 在培養期後，將含有抗體之洗滌緩衝劑吸除，然後將孔用400 µL的洗滌緩衝劑洗滌兩次。
如實施例B1至B28中任一者之方法，其中該對象係人類。 如實施例B1至B29中任一者之方法，其中該對象患有造血系統之過度增生性病症或癌症。 在又另一組實施例（實施例組D）中，提供： D1.
經單離T淋巴球群可係一種類型T淋巴球之同種族群或二或更多種類型T淋巴球之異種族群。 經單離T淋巴球群亦可係具有T淋巴球及至少一種T淋巴球以外之細胞（例如，B細胞、巨噬細胞、嗜中性球、紅血球、肝細胞、內皮細胞、上皮細胞、肌肉細胞、腦細胞等）的異種族群。 異種族群可具有.01%至約100% T淋巴球。 因此，經單離T淋巴球群可具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、或99% T淋巴球。 經單離T淋巴球群可僅包括一種類型的T淋巴球、或多於一種類型的T淋巴球之混合物。
如實施例A1至A24中任一者之方法，其進一步包含將該等iPSC離體分化為所欲細胞類型之細胞。 如實施例A26之方法，其進一步包含向對象投予經分化之該等細胞。 如實施例A1至A27中任一者之方法，其中所生產之該等iPSC對仙台病毒載體呈陰性。 如實施例A1至A28中任一者之方法，其中所生產之該等iPSC係衍生自γδ T細胞。
- 如本文中所使用，「多核苷酸序列」可指多核苷酸材料本身及/或指生物化學上表徵特定核酸之序列資訊（即，用作為鹼基縮寫之一連串字母）。
- 在某些實施例中，所生產之iPSC具有TRG及TRD基因座之重排基因。
- 作為陰性對照組，使用22 Rv1細胞系基因組DNA。
- 用於製備分子庫之方法在所屬技術領域中係熟知的，且許多庫可自商業或非商業來源取得。
- 在某些實施例中，經單離細胞群不會內源地表現任何重編程轉錄因子。
在某些實施例中，在活化培養物中培養第一段時間後，經單離細胞群包含5%至25% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養第一段時間後，經單離細胞群包含5%至20% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養第一段時間後，經單離細胞群包含5%至15% γδ T細胞。
例如，重編程包括將多潛能細胞反轉回多能細胞、將終末分化細胞反轉回多潛能細胞或多能細胞。 在一個實施例中，體細胞之重編程會將體細胞一路轉回多能狀態。 在另一實施例中，體細胞之重編程會將體細胞轉回多潛能狀態。 如本文中所使用，用語「較低分化狀態(less-differentiated state)」因而是相對用語，且包括完全去分化狀態及經部分分化狀態。 用語「蛋白質」及「多肽」在本文中可互換使用。 肽是相對短之多肽，一般長度係在約2與60個胺基酸之間。
例如，經單離細胞群係在活化培養物中培養至多13天、至多12天、至多11天、至多10天、至多9天、至多8天、至多7天、至多6天、至多5天、至多4天、至多3天、至多2天、或至多1天。 在一具體實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養至多5天。 副甲狀腺荷爾蒙 在一具體較佳實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養至多3天。 在一具體較佳實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養約3天。 「多核苷酸」在本文中可與「核酸」互換使用以指示核苷之聚合物。
T淋巴球可係調節T細胞，其包括nTreg（天然Treg）、iTreg（誘導性Treg）、CD8 +Treg、調節Tr1細胞、及Th3細胞。 額外類型的輔助T細胞包括諸如Th3 、Th17、Th9、或Tfh細胞之細胞。 額外類型的記憶T細胞包括諸如中央記憶T細胞（T CM細胞）、效應記憶T細胞（T EM細胞及T EMRA細胞）之細胞。 T淋巴球亦可指經基因工程改造之T淋巴球，諸如經修飾以表現T細胞受體或嵌合抗原受體之T淋巴球。