克隆的所有阶段均以PCR和多重限制性消化进行了确认。 用测序和PCR检查了最终病毒中的El区、转基因和纤毛，然后将所述最终病毒带到洁净的实验室用于生产。 本发明的溶瘤性腺病毒载体是基于腺病毒血清型5仏肪）核酸骨架、在腺病毒El的Rb结合恒定区2中的Mbp的缺失（DM)、和替代腺病毒E 3区中缺失的 gpl9k/6. 7K的编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)的核酸序列的（图1)。在本发明的优选实施方式中，所述腺病毒载体是基于人腺病毒的。 此外，保证了基因疗法的更有效和准确的基因递送以及增加的特异性和足够的肿瘤杀伤能力。 本发明通过以新的和有创造性的方式利用腺病毒的溶瘤和免疫治疗特性，提供了具有前述特性的癌症治疗工具。 血清型被分为6个亚组A-F并且不同的血清型已知与不同的病况（即呼吸系统疾病、结膜炎和肠胃炎）相关。
总之，在体外，Ad5-D24-GMCSF与阳性对照具有相似的溶瘤活性，并且因此转基因的产生并没有危害病毒的溶瘤能力（图fe-c)。对于Ad5/3-DM-GM-CSF和 Ad5-RGD-D24-GM-CSF显示了相似的数据（图5d)。 可用外科手术、激素疗法、化学疗法和/或放射疗法治疗癌症，但是在许多情况下，通常表征为晚期的癌症不能用目前的疗法治愈。 权利要求33的所述方法，其特征在于所述肿瘤为乳腺癌，结直肠癌，胰腺癌，头颈癌，黑色素瘤，卵巢癌，前列腺癌，非小细胞肺癌中之一。 如权利要求13所述的缀合物，其所述共价键连接包含直接共价键，肽键，酯键， 二硫键，酰胺键，酰亚胺键，磷酸二酯键，脲键，异氰酸酯键，或它们的组合。 本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。 实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。
副甲状腺癌: 副甲状腺癌
如权利要求1所述的肿瘤靶向多肽，其特征在于所述肿瘤靶向多肽为氨基酸序列为SEQ ID NO.1-4或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9中之一的多肽或其修饰衍生物。 以2μM的样品浓度，将多种重组突变体样品与体外培养的人乳腺癌细胞Bcap细胞共孵育12h，采用激光共聚焦技术分析、观察各突变体的穿膜效率。 将扩增片段采用DNA片段回收试剂盒纯化，并以Bam HI和Xho I双酶切，回收片段。同时以BamHI和XhoI双酶切TCS-HBD-pET28b载体质粒，回收载体片段。并用T4DNA连接酶进行连接。转化E.coli DH5α菌株，37℃过夜培养15h，质粒DNA回收试剂盒纯化重组质粒DNA，送DNA序列测序公司测序验证。。 采用DNA人工固相合成方法合成两端带Bam HI和Xho I酶切位点的DNA序列，该序列经过密码子优化，编码穿膜肽TAT。 将此人工合成DNA片段插入到已用Bam HI+Xho I双酶切的EGFP-ELBD-HBD-pET28a表达载体中，转化E.coli DH5α菌株，37℃过夜培养15h，质粒DNA回收试剂盒纯化重组质粒DNA，送DNA序列测序公司测序验证。 本发明包括编码本发明所述“肿瘤靶向肽”或肿瘤细胞靶向性穿膜肽或含其的融合蛋白的DNA以及含有这些DNA的载体、转化体。
- 相似的或不同的表达盒可被插入一个载体或数个不同的载体中。
- 开放阅读框（ORFs)可以在相同的DNA链中或不同的DNA链中， 在本发明的优选实施方式中，El区包含病毒包装信号。
- 本申请描述了重组病毒载体的构建，与所述载体相关的方法和它们在肿瘤细胞系、动物模型及癌症患者中的用途。
- 另一方面，本发明公开了治疗带有肿瘤的生物个体的方法，包含给予此生物个体有效剂量的本发明所述缀合物；所述肿瘤包含表达至少一个EGFR家族成员的细胞。
- 本文所述多肽，包括但不限于“肿瘤靶向肽”、“细胞穿膜肽”、“肿瘤细胞靶向性穿膜肽”，其修饰衍生物可采用现有技术领域常规方法对本发明所述的肿瘤靶向肽进行修饰。
对于荧光素酶检测，为了测试衣壳修饰对转导效力的影响，将细胞接种到两个M 孔板中，50000细胞/孔。 24h后，用Ad51ucl或Ad5/31ucl以2% DMEM中500vp/细胞和 5000/vp/细胞的浓度一式三份感染细胞。 如同在实施例3III中类似地分析荧光素酶的表达（确定中和抗体滴度）。 图7c显示了通过在归档的肿瘤样品中对Ad5-D25_GMCSF的受体CAR(柯萨奇-腺病毒受体）进行染色，而对Ad5-D25-GMCSF转导肿瘤的预测。 图fe-d显示了 GMCSF的表达不损害病毒复制和细胞杀伤效果。 与现有技术的腺病毒工具相比，本发明提供了用于癌症治疗的更简单、更有效、不昂贵、无毒的和/或更安全的工具。
副甲状腺癌: 副甲状腺がんはどんな病気ですか
TCS是一种来源于植物括楼块茎的具有抗肿瘤活性的药物蛋白，其具有核糖体失活蛋白的活性，在体外无细胞系统中能够抑制蛋白质合成。 从图6中可以看出，ELBD能够在更低的浓度下与HeLa细胞表面受体结合，表明ELBD序列更容易与癌细胞表面结合，而更容易结合细胞表面进一步促进了重组蛋白的穿膜效率。 以EGFP-ELBD-HBD-pET28a质粒为载体，人工固相合成两端带有Sal I和Xho I酶切位点的DNA序列，该序列经过E.coli密码子优化，并编码H2穿膜肽，其中H2是另一种人源性穿膜肽，来源于肝素类生长因子。将EGFP-Tn-HBD-pET28a表达载体用Sal I与Xho I双酶切，并与合成的此片段利用T4DNA连接酶连接。 已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使多核苷酸与载体可操作相连。
这些细胞被鉴别为含有下列免疫表现型标志物的一种或多种：CD4+，CD25+，FoxP3+, CD127-和GITR+。 此类减少T抑制因子或调节性T 细胞的试剂可选自：抗CD25抗体或化疗剂。 更特别地，本发明涉及溶瘤性腺病毒载体以及包含所述载体的细胞和药物组合物。
副甲状腺癌: 副甲状腺機能亢進症顎腫瘍症候群（Hyperparathyroidism-jaw tumor syndrome：HPT-JT症候群）
①EGFP-ELBD-TAT-pET28a质粒构建方案如实施例1中所述。 从保藏菌株的固体LB培养基平板上挑取一个转化有EGFP-ELBD-TAT-pET28a质粒的单菌落于30ml含有卡那霉素(10-50mg/L)的LB液体培养基中在37℃振荡培养至OD600约为0.5-1.0。 ③将培养温度调整到15-20℃范围内，加入适量的IPTG(0.1-10mM)诱导目标蛋白表达，继续培养10-20h，低速离心收集菌体。 ①EGFP-TAT-pET28a质粒构建方案如实施例1中所述。 从保藏菌株的固体LB培养基平板上挑取一个转化有EGFP-TAT-pET28a质粒的单菌落于30ml含有卡那霉素(10-50mg/L)的LB液体培养基中在37℃振荡培养至OD600约为0.5-1.0。 ①EGFP-ELBD-H2-pET28a质粒构建方案如实施例1中所述。
本发明实现了癌症的治疗，其中肿瘤细胞通过病毒粒子引起的溶瘤作用被破坏。 此外，影响了各种不同的活化人免疫应答的机制，包括活化天然杀伤细胞（NK)和树突细胞。 副甲状腺癌 “肿瘤靶向肽”为是指一类短肽序列，是对EGFR结合的S3模拟肽氨基酸序列结构进行人工突变改造优化，获得一种专一性结合能力更好的肿瘤靶向肽结构。
副甲状腺癌: 分子標的薬治療
在一些实施方式中，所述治疗成分包含细胞穿膜肽，优选为所述细胞穿膜肽为SEQ ID NO.12氨基酸序列所示的多肽，来自HIV的反式激活蛋白TAT的氨基酸片段，EC-SOD来源的肝素结合域的氨基酸片段，HBEGF来源的肝素结合域的氨基酸片段，或它们的衍生物。 另一方面，本发明还公开了一种缀合物，其包含权利要求1所述肿瘤靶向多肽和一种活性成分，二者通过一种连接器缀合，其中所述活性成分为治疗成分，诊断成分，放射性同位素，放射性核素，毒素，或它们的组合物。 在表1中总结了经Ad5-DM_GMCSF 治疗的患者血清中的病毒负荷。 使用定量PCR用于所述分析（关于方法的描述参见第III部分）。 以Ix 副甲状腺癌 IO4细胞/孔将293细胞接种在96孔板上并培养过夜。 为了检查肿瘤可以被基于Ad5的病毒感染，将取自组织的活体样本均质化并根据标准的感染方案用编码荧光素酶的Ad5Lucl使其感染。
- 通过超声引导的肿瘤内注射施用病毒，而大约五分之一的剂量被静脉内施与。
- 固态载体包括：淀粉、乳糖、磷酸氢钙、微晶纤维素、蔗糖、白陶土、微粉硅胶、滑石粉、低取代羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、聚乙烯吡咯烷酮。
- 34.在细胞中生产GM-CSF的方法，其中所述方法包括：a)将包含根据权利要求1-15中任一项的溶瘤性腺病毒载体的媒介运送至细胞，和b)在所述细胞中表达所述载体的GM-CSF。
- 在另一个优选的载体中，腺病毒核酸骨架大部分源自Ad5并且结合了 Ad3的一部分（例如，衣壳结构的一部分）。
- 在所述载体中，所述区域可以以任何顺序，但是在本发明的优选实施方式中，所述区域按照顺次顺序在5’至3’的方向上。
此外，在抗体的存在下，病毒被中和，从而其可丧失其感染转移的效力。 然而，抗肿瘤而被诱导的效应T细胞或NK细胞自由循环并最终消灭远离经注射的肿瘤的转移。 为了表明表达GMCSF的腺病毒能够引起腺病毒和肿瘤特异性免疫性，通过 INF- y ELI SPOT分析收集自经治疗的患者的PBMC。 在本发明的一个实施方式中，所述方法或用途还包括施用化学疗法或抗CD20治疗或其它阻断中和抗体的方法。 “抗CD20治疗”指能够杀死CD20阳性细胞的试剂，可选自利妥昔单抗和其它抗CD20单克隆抗体。 “阻断中和抗体的方法”指能够抑制通常由感染产生的抗病毒抗体的生成的试剂，可选自：不同的化疗剂、免疫调节性物质、肾上腺皮质素和其它药物。
副甲状腺癌: 副甲状腺腫瘍とは
简要地，用PBS将接种于孔中的细胞清洗两次，融化病毒并重悬于最少量的生长培养基中且轻轻地倒在细胞上。 感染进行了 30分钟，随后在PBS中再次清洗细胞并加入适量的完全生长培养基。 需注意仅获得了少量的组织，因此不能计算细胞的数目，也不能计算相对于组织的量校准过的病毒量。 副甲状腺癌 因此，没有进行定量的分析，但是定性的数据显示了在患者012和C3 中成功的基因转移（图7a-b)。减去了背景荧光素酶的值（大约200RLU)。
在这方面最相关的免疫细胞是天然杀伤细胞（NK)和细胞毒性⑶8+T细胞。 本发明所要解决的技术问题为提供一种能够高效专一性识别和具有更强结合力的多肽结构，其能与肿瘤细胞表面大量过表达存在的表皮生长因子受体专一性结合，从而可被用于肿瘤细胞的标记性识别诊断，或竞争性与EGFR结合，或携带肿瘤治疗药物分子达到肿瘤细胞表面，发挥靶向性治疗作用。 表达盒被用于通过利用载体而在靶标（例如细胞）中表达转基因。 如在本申请中所用的，表述“表达盒”指包含编码cDNA或基因的核苷酸序列，以及控制和/或调节所述 cDNA或基因的表达的核苷酸序列的DNA载体或其部分。
副甲状腺癌: 副甲状腺腫瘍の
与EGFR结合的这些配体分子，在空间结构上具有非常类似并保守的三维结构，即配体分子内部通过多肽链内二硫键的作用(Cys6–Cys20，Cys14–Cys31，Cys33–Cys42)而形成典型的三环状结构4。 Ad5基因组含有早期（E1-4)，中期（IX和IVa2)以及晚期（Ll_5)基因，侧翼是左侧和右侧的反向末端重复（分别为LITR和RITR)，所述反向末端重复含有DNA复制所需的序列。所述基因组还含有包装信号（Ψ)和主要晚期启动子（MLP)。 图8b显示了肿瘤内注射Ad5-DM_GMCSF引起了叙利亚仓鼠的血清中高水平的 hGMCSF。 在第4天对用或Ad5-DM_GMCSF处理的动物进行取样并通过FACSARRAY 评估血清中人GMCSF的浓度。
图9a_b中显示了在Ad5-DM-GM_CSF治疗之前和之后，患有卵巢癌的患者和患有间皮瘤的患者（见表1)的CT扫描。 使用提取自Ad5/3-DM-Cox2L(lX vp/ml)在正常人血清中的系列稀释液的 DNA来生成回归标准曲线。 对于所述检测而言，检测的极限和定量的极限是500vp/ml血清。 在相同的PCR操作（PCR run)中使用TaqMan外源性内部阳性对照试剂（Applied Biosystems)来就PCR抑制剂的存在测试各样品。 副甲状腺癌 分析了分别来自患者K75和V136的腹水和胸腔积液的新鲜的、处理前的样品，在两种样品中均见到了 Ad5/3的高转导。 所述药物组合物可以是适于施用的任何形式，例如固体、半固体或液体形式。
副甲状腺癌: 患者さんの手記
然而，在本发明优选的实施方式中，在治疗期间中施用溶瘤性腺病毒载体或药物组合物数次。 溶瘤性腺病毒载体或药物组合物可例如，在前2周、4周、每月或在治疗期间中被施用1至10次。 在本发明的一个实施方式中，在前2周中、然后在4周、然后每月进行3-7次施用。 在本发明的特定实施方式中，在前2周中、然后在4周、然后每月进行4次施用。 治疗期间的长度可变化，例如可持续2-12个月或更长。 可使用任何常规的方法来将所述载体或组合物施用给受试者。
除了使得载体能够转运到目的位点，本发明的载体也确保了转基因的表达和持续。 如权利要求21所述的缀合物，其特征在于所述放射性诊断成分包含氟-18，锝-99，钼-99，铷-82，锶-82，铊-201，或它们的组合物。 如权利要求12所述的缀合物，其特征在于所述诊断成分包含放射性诊断成分，荧光成分，量子点，或它们的组合物。 将TCS的基因序列与ELBD突变体核苷酸序列以及H2穿膜肽序列融合表达后，其TCS-ELBD-H2对B16(鼠黑色素瘤细胞)的抑制率显著提高(图7)。
副甲状腺癌: 患者様へ病気と治療
此“0期”同情使用项目在HUCH外科伦理委员会得到了讨论。 具有晚期的和难以治疗的实体肿瘤的患者参加了政府批准的同情 治疗方案。 接受Ad5-DM-GM_CSF的患者的信息在表1中列出。 如在本申请中所使用的，衣壳的“Ad5/3嵌合体”指嵌合体，其中纤毛的节部分来自 Ad血清型3而纤毛的其余部分来自Ad血清型5。 如在本申请中所使用的，表述“病毒包装信号“指病毒DNA的一部分，其由一系列富含AT的序列组成并且控制衣壳化过程。
副甲状腺癌: 副甲状腺について
权利要求30所述的药物组合物，其特征在于其还包含放射性治疗成分，放射性核素，毒素，治疗成分，化学治疗成分，或它们的组合。 如权利要求18所述的缀合物，其特征在于所述放射性治疗成分包含放射性同位素，所示放射性同位素为碘-131，镥-177，钇-90，钐-153，磷-32，铯-131，钯-103，镭-223，碘-125，硼-10，锕-225，铋-213，镭-225，铅-212，钍-232，或它们的组合。 如权利要求15所述的缀合物，其特征在于所述缀合物包含氨基酸序列为SEQ ID NO.13-15中之一的多肽。
副甲状腺癌: 甲状腺がん 患者数（がん統計）
23.根据权利要求19-22中任一项的用途或方法，其中所述施用是通过肿瘤内、肌内、 动脉内、静脉内、胸膜内、囊内、腔内或腹膜注射进行的，或者是口服施用。 副甲状腺癌 通过超声引导的肿瘤内注射施用病毒，而大约五分之一的剂量被静脉内施与。 基于他人发表的安全性结果选择了 8xl01(lVP的起始剂量。
适当宿主的代表性例子包括但不限于：细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞(如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母)；昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾SF9细胞；动物细胞，如CHO,COS,NSO,293和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。 本发明还包括通过合成和重组技术生产本发明的肿瘤靶向肽”或肿瘤细胞靶向性穿膜肽或含其的融合蛋白的方法。 通过本领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、转化体和生物体。 本发明所述多肽，包括但不限于“肿瘤靶向肽”、“细胞穿膜肽”、“肿瘤细胞靶向性穿膜肽”，可按照常规的多肽合成技术进行固相合成或液相合成或液固相合成。
在本发明中可使用改善病毒向肿瘤细胞的递送的任何衣壳修饰（即本领域已知的对六邻体、纤毛和/或五邻体基质蛋白的修饰）。 在本发明的优选实施方式中， 所述衣壳修饰是Ad5/3嵌合体，将整联蛋白结合（RGD)区和/或结合硫酸肝素的聚赖氨酸修饰插入纤毛中。在本发明的特定实施方式中，所述衣壳修饰是Ad5/3嵌合体。 使用外源的组织或肿瘤特异性启动子在重组腺病毒载体中是常见的并且它们也可被用于本发明中。 例如，可通过例如启动子将病毒复制限制在靶细胞中，所述启动子包括但不限于CEA，SLP，Cox-2，肝素结合细胞因子，hTERT，hTERT的变体，E2F，E2F的变体，CXCR4，SCCA2和TTS。
通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的所述融合蛋白较为有利，所述方法包括硫酸按或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、疏水电荷作用层析和凝集素层析。 含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载体的方法。 用噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切核酸酶限制性消化产生的DNA区段，所述的两种聚合酶用其3′,5’-核酸外切活性除去突出的γ-单链末端，并用其聚合活性补平3’-凹端。 然后在能催化平端DNA分子连接的酶，如噬菌体T4DNA连接酶的存在下将平端区段与大摩尔过量的接头分子一起保温。
这一方法结合了常规基因递送的优点与能够复制的试剂的效力。 副甲状腺癌 装备病毒的一个目标是诱导针对允许病毒复制的细胞的免疫反应。 单独的病毒复制虽然是免疫原性的，但是通常不足以诱导有效的抗肿瘤免疫性。 为了强化对治疗性免疫性的诱导，可用激发性蛋白（例如细胞因子）装备病毒，用于促进将肿瘤抗原引入抗原呈递细胞（例如树突细胞），以及用于它们的激发和/或成熟。 将免疫治疗性基因引入肿瘤细胞中以及蛋白质的翻译，导致免疫应答的活化和有效地破坏肿瘤细胞。