一種神經細胞用於治療神經疾病之用途，其包含自幹細胞活體外分化之許旺細胞，該許旺細胞表現外源性CD47多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該許旺細胞展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。 一種神經細胞用於治療神經疾病之用途，其包含自幹細胞活體外分化之神經細胞，該神經細胞表現外源性CD47多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該神經細胞展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。 在一些實施例中，Cas蛋白質可以編碼Cas蛋白質之核酸形式引入含有目標多核苷酸序列之細胞中。 適合技術包括磷酸鈣或脂質介導之轉染、電穿孔及使用病毒載體轉導或感染。 在一些實施例中，核酸包含如本文所描述之經修飾mRNA(例如合成經修飾mRNA)。
如請求項1至11中任一項之方法，其中該神經細胞群在投與後在該患者中存活及/或發揮功能至少一個月、兩個月、三個月、四個月或更長時間。 如請求項1至9中任一項之方法，其中在該患者經歷繼發於神經病症或病況之該患者之血腦障壁的後續破壞之後，該神經細胞群在該患者中維持長期功能。 [圖13]描繪如實例6中所描述之自野生型及dKO/CD47Tg iPSC分化之成熟神經元的免疫螢光成像。
分子治療: 疫苗超級英雄漫畫
如請求項131至138中任一項之方法，其中在該患者經歷繼發於該神經病症或病況之該患者之血腦障壁的後續破壞之後，該神經細胞群在該患者中維持長期功能。 如請求項80至91中任一項之方法，其中該神經細胞係選自由以下組成之群組：腦內皮細胞、神經元、室管膜細胞、星狀細胞、小神經膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞、許旺細胞、其先驅細胞及其前驅細胞。 如請求項80至89中任一項之方法，其中在投與該神經細胞群之前、期間及/或之後不向該患者投與免疫抑制劑。 如請求項80至88中任一項之方法，其中該神經細胞群在投與後在該患者中存活及/或發揮功能至少一個月、兩個月、三個月、四個月或更長時間。
在一些實施例中，該等細胞衍生自逃避接受個體之免疫識別的富潛能幹細胞。 需要適用於治療A型血友病之基因療法方法的編碼功能因子VIII蛋白之新穎AAV載體，及包含其之重組AAV病毒粒子。 因此，本發明涉及編碼功能活性FVIII之AAV載體，使得重組AAV病毒使編碼治療蛋白之整個核 酸衣殼化，即完全包裝AAV FVIII載體，進而避免上文所提及之過大基因組問題，或至少產生功能活性因子VIII蛋白，其可經或可未經截短。
分子治療: Taxes and tax credits
[圖6]描繪移植至健康同種異體BALB/c小鼠腦部之紋狀體中的dKO/CD47Tg(B2M-/-CIITA-/-CD47tg) EC的生物發光成像。 將小鼠iPSC衍生之內皮細胞移植至健康同種異體BALB/c小鼠之紋狀體中。 [圖4]描繪移植至健康同種異體BALB/c小鼠腦部之紋狀體中之野生型EC的生物發光成像。 當動物失去意識時，記錄其重量且將動物頭頂自眼睛高度刮毛至耳後。 在中風小鼠模型-局部腦缺血小鼠模型中評估根據上述方法生成之內皮細胞。
- 在許多實施例中，在投與該神經細胞群之後不向該患者投與免疫抑制劑。
- 藉由AAV5-FVIII-SQ進行正常CD-1小鼠中之一個GLP單次劑量研究，伴以4週及13週隨訪時段。
- 本領域中熟習此項技術者將容易瞭解，待在任何特定細胞中改變之所期望目標多核苷酸序列可對應於基因體序列之表現與病症相關或以其他方式促進病原體進入細胞中之任何基因體序列。
- 細胞可直接植入所需部位，或者藉由任何適當途徑投與，該途徑使得遞送至個體中之所需位置，其中植入細胞之至少一部分或細胞組分保持存活。
- 在一些實施例中，一或兩種核糖核酸(例如引導RNA)與目標多核苷酸序列之同一股上之序列互補及/或雜交。
在一些實施例中，神經細胞無法將小神經膠質細胞募集及/或活化至移植或植入部位。 在一些實施例中，神經細胞無法在移植或植入部位處促進或誘導小神經膠質細胞之增殖。 分子治療 分子治療 在一些實施例中，接受個體中之小神經膠質細胞不滲入含有神經細胞之移植或植入部位。
分子治療: 疫苗安全
在一些實施例中，將本文所描述之低免疫原性神經細胞及/或其先驅細胞投與至個體以緩解帕金森氏症之症狀或影響，該等神經細胞及/或其先驅細胞包括但不限於腦內皮細胞、神經元、多巴胺神經元、神經膠質細胞、腦內皮先驅細胞、神經元先驅細胞、多巴胺神經元先驅細胞及神經膠質先驅細胞。 在一些實施例中，將多巴胺能神經元及/或其先驅細胞投與至患有帕金森氏症之患者。 在一些實施例中，將本文所描述之低免疫原性神經細胞投與至個體以改善或治療中風，該等神經細胞包括但不限於腦內皮細胞、神經元、多巴胺神經元、神經膠質細胞、腦內皮先驅細胞、神經元先驅細胞、多巴胺神經元先驅細胞及神經膠質先驅細胞。
感受態細胞接著在大致42℃之溫度下進行加熱30秒且接著在冰上冷卻2分鐘。 SOC添加至細胞且使其在37℃下在攪拌下培育4小時以允許重組發生。 在培育期期間，X-gal擴散至兩個LB盤(另外含有各種抗生素(例如康黴素、健大黴素及四環素)上用於轉型，接著為IPTG。 使用7-0可吸收縫合線及倒置的簡單間斷縫線閉合皮膚切口。
分子治療: 免疫系統嚴重或中度受損兒童接種第三劑疫苗的資格
在另一實施例中，本發明提供產生包含本發明之AAV載體中的任一者之重組腺相關病毒粒子之方法。 所述方法包含培養已經本發明之AAV載體中的任一者(與各種AAV cap及rep基因結合)轉染之細胞及自經轉 染細胞之上清液回收重組AAV FVIII病毒粒子之步驟。 將本文所描述之多核苷酸引入細胞中之方法可藉由任何適合之技術達成。 在一些實施例中，經由病毒轉導(例如慢病毒轉導)將多核苷酸引入細胞中。 在一些實施例中，編碼Cas蛋白質之核酸及編碼至少一至兩種核糖核酸之核酸經由病毒轉導(例如慢病毒轉導)引入至細胞中。
未在小鼠與食蟹獼猴及恆河猴之間注意到可確定更精確劑量推薦之一致種間比放。 10倍安全容限係基於最高投予劑量下之正常小鼠中之GLP13週研究中之6E13 vg/kg AAV5-FVIII-SQ之NOAEL。 未在8週之後在至多6E13 vg/kg劑量、10倍安全容限之猴中觀測到臨床觀測或化學之AAV5-FVIII-SQ相關變化。 總體而言，除了分別在正常小鼠及猴中之6E13 vg/kg之最高投予劑量下觀測到所有動物中預期形成抗AAV5抗體及免疫活性動物中有限形成低滴度抗FVIII-SQ抗體，無AAV5-FVIII-SQ相關發現。 非人類靈長類動物中之短暫FVIII-SQ表現疑似為物種特異性的且不預期在臨床中出現，其如在已在人類患者中實現穩定轉殖基因表現之其他臨床研究中可見。 在進一步增加B域及a3域缺失FVIII之表現的嘗試中，34鹼基人類ApoE/C1增強子之第二複本以正向或反向插入Proto 分子治療 5載體中。
分子治療: 接種疫苗
Proto 6之序列之核苷酸序列闡述於SEQ ID NO：7中。 為了產生AAV載體Proto 分子治療 2S，合成100鹼基內含子插入Proto 1S載體中之FVIII-SQ序列之外顯子1與2之間。 34鹼基ApoE/C1增強子及32鹼基人類AAT啟動子遠端X區自人類AAT啟動子之上遊移除且以反向(相比於此等元件位於人類AAT啟動子上游時之定向)插入至合成內含子中。 Proto 2S之序列之核苷酸序列闡述於SEQ ID NO：3中。 本發明亦關於治療罹患A型血友病之個體之方法，其包含以下步驟：測定所述個體之血清中不存在抗AAV衣殼抗體，及向所述個體投予治療有效量之重組AAV FVIII病毒。
- 在一些情況下，細胞特異性啟動子在本文所描述之任何神經細胞類型中均具有活性。
- 在一些實施例中，在該患者經歷繼發於神經病症或病況之該患者之血腦障壁的後續破壞之後，該神經細胞群在該患者中維持長期存活。
- 在一些實施例中，CRISPR/Cas系統包括Cas蛋白質及能夠將Cas蛋白質引導至目標多核苷酸序列之目標模體並與其雜交的至少一種至兩種核糖核酸。
- 在一些實施例中，位點特異性結合域衍生自CRISPR/Cas系統。
緩慢添加一定量沈澱緩衝液(例如包含3.0M乙酸鉀，pH 5.5之緩衝液)且所述管經倒置若干次以混合緩衝液且接著在冰上培育大致10分鐘。 所述管以全速離心大致10 分鐘且上清液倒入含有異丙醇之管中。 獲得一定量培育混合物，經稀釋且接著擴散至兩個LB盤上且在37℃下培育大致30-48小時。 若干白色菌落選自各盤且在含有與LB盤中所提供相同的抗生素組合之LB培養基中培養隔夜。 隨後，製備穿梭載體DNA及甘油儲備液且儲存於-80℃下。 添加重組穿梭質體(例如pFB-GFP)且與感受態細胞平緩地混合且在冰上培育30分鐘。
分子治療: 核酸医薬
本文發明人已展示Proto 1產生感染性重組AAV病毒且編碼功能因子VIII多肽。 TI分析可採用已預先引入AAV誘導性報告載體之宿主細胞。 報告載體可包含在藉由AAV病毒轉導宿主細胞時誘導表現之誘導性報告基因，如GFP等。 能夠防止/減少宿主細胞轉導存在於人類血清中之抗AAV衣殼抗體將進而減少報告基因於系統中之總體表現。 因此，此類分析可用於偵測能夠藉由治療性FVIII AAV病毒預防/減少細胞轉導之人類血清中之抗AAV衣殼 抗體之存在。
在一些實施例中，神經細胞及富潛能幹細胞顯示MHC I類抗原及/或MHC II類抗原之降低含量或活性。 分子治療 在某些情況下，BMP信號傳導抑制劑係LDN193189、SB431542或其組合。 例示性分化培養基可包括可促進或能夠生成如熟習此項技術者所辨識之神經膠質細胞類型的任何特異性因子及/或小分子。 在一些實施例中，本文所描述之低免疫細胞為已自諸如誘導性富潛能幹細胞之富潛能幹細胞分化之多巴胺神經元，包括神經元幹細胞、神經元先驅細胞、不成熟多巴胺神經元及成熟多巴胺神經元。
分子治療: Taxes and tax credits
使用CRISPR/Cas系統剔除目標多核苷酸序列或其部分可適用於各種應用。 舉例而言，剔除細胞中之目標多核苷酸序列可出於研究目的活體外進行。 出於離體目的，剔除細胞中之目標多核苷酸序列可適用於治療或預防與目標多核苷酸序列之表現相關之病症(例如藉由離體剔除細胞中之突變對偶基因且將包含經剔除突變對偶基因之彼等細胞引入個體中)。 在額外或替代態樣中，本發明技術考慮以可供本領域中熟習此項技術者使用之任何方式，例如利用核酸酶系統，諸如TAL效應物核酸酶或鋅指核酸酶系統改變目標多核苷酸序列。 應理解，儘管本文詳細描述了利用CRISPR/Cas(例如，Cas9及Cpf1)及TALEN之方法之實例，但本發明技術不限於使用此等方法/系統。 本文中可利用本領域中熟習此項技術者已知之靶向例如B2M以降低或消除目標細胞中之表現之其他方法。
本發明亦關於產生具有高FVIII表現活性之AAV FVIII載體。 最後，本發明涉及包含AAV因子VIII載體之醫藥調配物及/或包含本文中描述之AAV FVIII載體中的任一者之重組因子VIII AAV粒子/病毒、相關醫藥調配物及治療罹患A型血友病之個體中之所述疾病的相關投予方法。 一種神經細胞用於治療神經疾病之用途，其包含自幹細胞活體外分化之神經元，該神經元表現外源性CD24多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該神經元展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。 一種神經細胞用於治療神經疾病之用途，其包含自幹細胞活體外分化之神經元，該神經元表現外源性CD47多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該神經元展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。 本文提供一種自幹細胞活體外分化之神經元，該神經元表現外源性CD47多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該神經元展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。
分子治療: 疫苗超級英雄漫畫
為避開同種異體移植後之免疫排斥，對低免疫原性iPSC進行工程改造以藉由使用CRISPR-Cas9及引導物使B2M及CIITA基因不活化來消耗主要組織相容複合體I類及II類抗原決定基兩者來避開同種異體免疫識別，且達成CD47過度表現以保護免受先天性免疫殺滅。 除HLA I及II(或MHC I及II)減少以外，低免疫原性細胞對巨噬細胞吞噬作用及NK細胞殺滅之易感性降低。 所得低免疫原性細胞由於一或多種CD47轉基因或一或多種CD24轉基因之表現而「逃避」免疫巨噬細胞及先天性路徑。 如本領域中熟習此項技術者亦瞭解，可使用或使用之再程式化因子之數目可變化。
分子治療: 接種疫苗
在許多實施例中，該神經細胞群在投與後在該患者中存活及/或發揮功能至少一個月、兩個月、三個月、四個月或更長時間。 在一些實施例中，在該患者經歷繼發於神經病症或病況之該患者之血腦障壁的後續破壞之後，該神經細胞群在該患者中維持長期功能。 在其他實施例中，該患者之血腦障壁之該後續破壞係歸因於感染或中風。
分子治療: 免疫系統嚴重或中度受損兒童接種第三劑疫苗的資格
所產生多巴胺之含量係藉由量測動作電位在其已達到其最大幅度之一半之點處的寬度(尖峰半最大寬度)而計算。 多巴胺神經元(亦稱為多巴胺能神經元)包括神經元細胞，其表現酪胺酸羥化酶，亦即用於多巴胺合成之限速酶。 在一些實施例中，多巴胺神經元分泌神經傳遞質多巴胺，且幾乎沒有或沒有多巴胺羥化酶之表現。 分子治療 多巴胺神經元可表現以下標記中之一或多者：神經元特異性烯醇酶、1-芳族胺基酸脫羧酶、囊泡單胺轉運蛋白2、多巴胺轉運蛋白、Nurrl及多巴胺-2受體(D2受體)。
分子治療: 疫苗安全
此兩種調節元件就其於Proto 1S中之定向而言以反向插入。 長度為4983個鹼基之所得Proto 2S載體以示意性形式顯示於圖2C中，且闡述於SEQ ID NO：3中。 偵測抗AAV衣殼抗體之TAb分析可採用固相結合AAV衣殼作為人類血清越過之「捕獲劑」，進而允許存在於血清中之抗衣殼抗體結合至固相結合衣殼「捕獲劑」。
分子治療: 核酸医薬
在更尤佳本發明實施例中，本發明之重組AAV FVIII調配物包含約1.42mg/ml二元磷酸鈉及約1.38mg/ml單水合一元磷酸鈉。 在本發明之另一態樣中，亦藉由允許複製AAV或產生生物產品，且可維持於培養物中之任何哺乳動物細胞類型進行本發明之方法。 使用的較佳哺乳動物細胞可為HEK293、HeLa、CHO、NS0、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT 分子治療 1080、A549、Cos-7、ARPE-19及MRC-5細胞。 在一些實施例中，輔助功能由包含腺病毒或桿狀病毒輔助基因之一或多種輔助質體或輔助病毒提供。 腺病毒或桿狀病毒輔助基因之非限制性實例包括(但不限於)E1A、E1B、E2A、E4及VA，其可向AAV包裝提供輔助功能。
如請求項10之用途，其中所述藥物與濃度介於5毫克/天至60毫克/天範圍內的皮質類固醇一起經至少3、4、5、6、7、8、9或10週或大於10週之連續時段預防性地投予。 如請求項18之用途，其中所述醫藥調配物包含濃度為約1.42mg/ml之二元磷酸鈉、濃度為約1.38mg/ml之單水合一元磷酸鈉、濃度為約8.18mg/ml之氯化鈉、濃度為約20mg/ml之甘露糖醇及濃度為約2mg/ml之泊洛沙姆188。 如請求項10之用途，其中所述藥物包含醫藥調配物，其中所述醫藥調配物包含緩衝劑、等張劑、膨化劑及界面活性劑。 如請求項1之醫藥調配物，其包含濃度為約1E12 vg/ml至約2E14 vg/ml之所述AAV FVIII病毒。