吾人鑑別與LM組織中之MSI-M相關之遺傳變化，藉由染色體組資料採擷選擇142種具有基因內微衛 星之候選基因且針對在24種展現MSI-M之LM組織中高頻率之MSI及LOH對其進行篩檢。 本案發明人確定：1)LM組織應含有肝轉移所必需之所有遺傳及/或後生變化，2)含有具有二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸重複之微衛星的基因可為誘發MSI-M之機制的標靶。 該種基因可在MSI-M陽性LM中富集，3)由於實例1中之研究顯示EMAST(MSI-M)與某些基因座處之頻繁LOH事件相關，17因此可連同MSI-M一起選擇特定基因座處之LOH。 在MSI-M陽性LM中展現高頻率LOH或MSI之基因座中，9p24.3上之SMARCA2R-LOH在LM及第IV期原發性CRC組織中與MSI-M相關，而在第II期及第III期原發性CRC組織中與此無關。 該實例顯示兩種事件(一種與MSI-M相關且另一種與SMARCA2R-LOH相關)導致癌細胞可勝任肝轉移。 在大腸直腸癌組織中，50-60%之偶發性原發性腫瘤展現EMAST，且MSH3之下調與MSI-L及EMAST相關。
圖6A至6D為LM及導致LM之原發性CRC中的MSI型態及SMARCA2R 腫瘤級別 LOH。 該圖提供來自圖6A：34例同時LM，圖6B：40例異時LM，圖6C：37例第IV期原發性CRC及圖6D：64例分析MSI及SMARCA2R處之LOH的導致LM之第II期/第III期原發性CRC的詳細資料。 各欄描繪以下：關於7種EMAST標記(1至7)、5種具有CA重複之標記(a至e)、2種具有單A重複之標記(f及g)的突變資料、MSI-M狀態、SMARCA2R LOH狀態。 腫瘤級別 對於MSI-M狀態，M表示MSI-M，HS表示H-MSS且H表示MSI-H。
腫瘤級別: TW201300777A – 預測大腸直腸癌轉移復發之生物標記
在與同時LM相關之第IV期原發性CRC中，高百分比之MSI-M腫瘤獲得SMARCA2R-LOH(64.3%，圖8C)。 該等結果暗示，已在腫瘤形成早期同時獲得MSI-M及SMARCA2R-LOH之CRC組織可能發展同時LM。 腫瘤級別 另一方面，在散播之後獲得SMARCA2R-LOH之MSI-M陽性CRC可能發展異時LM。 或者，在原發性組織中以微小群體存在之MSI-M及SMARCA2R-LOH雙陽性細胞若未經手術及/或化學療法去除，則可能發展異時LM。
在另一態樣中，個體樣本之大部分細胞中存在MSI-M表型或MSI-M及SMARCA2R-LOH表型表示在人類個體中存在高復發風險及降低之無復發存活機率。 在又一態樣中，一或多個細胞中存在MSI-M表型表示個體中存在轉移或高肝轉移風險。 在又一態樣中，該等生物樣本係選自由冷凍或新鮮組織樣本、FFPE組織樣本、生檢、糞便樣本、一或多種生物流 體或其任何組合組成之群。
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在一態樣中，SMARCA2R-LOH表型係使用SEQ ID NO：1至6之核酸(例如其中之核酸對)來確定。 在一態樣中，該方法進一步包含偵測SMARCA2R-LOH之存在，其中存在MSI-H與SMARCA2R-LOH兩者表示自原發性CRC發生肝轉移。 本文揭示之又一實施例係關於一種用於在患有或疑似患有原發性大腸直腸癌之人類個體中預測無復發存活之機率、確定復發風險、確定肝轉移風險或其任何組合之生物標記，其包含偵測樣本中之四核苷酸重複處之微衛星變化、低程度之二核苷酸重複基因座(MSI-L)或兩者，其中在來自第II期及第III期CRC個體之樣本中之大部分細胞中存在MSI-M、或MSI-M及SMARCA2R-LOH表型表示在人類個體中存在高復發風險、高肝轉移風險或其任何組合。 一種生物標記，其係用於在患有或疑似患有原發性大腸直腸癌之人類個體中預測無復發存活之機率、確定復發風險、確定肝轉移風險或其任何組合，其包含在樣本中偵測四核苷酸重複處之微衛星變化、低程度之二核苷酸重複基因座(MSI-L)或兩者，其中在來自第II期及第III期CRC個體的樣本中之大部分細胞中存在MSI-M、或MSI-M與SMARCA2R-LOH表型表示在該人類個體中存在高復發風險、高肝轉移風險或其任何組合。
- 在另一態樣中，該組包含BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250、D18S64、D18S69、 MYCL1、D20S82、D20S85、L17835、D8S321、D9S242及D19S394。
- MSI-M在轉移性第II期/第III期原發性CRC中之頻率顯著高於MSI-M在非轉移性第II期/第III期原發性CRC中或在第IV期原發性CRC中之頻率。
- 在該研究中，有跡象表明MSI-M牽涉於原發性CRC之肝轉移中。
- 在又一態樣中，一或多個細胞中存在MSI-M表型表示個體中存在轉移或高肝轉移風險。
- 然而，MSH3在介導ICL誘發劑之細胞毒性作用中之確切作用仍難以理解。
應瞭解，本文所述之特定實施例以說明方式展示，而非用於限制本發明。 熟習此項技術者將認知到或能夠僅使用常規實驗來確定本文所述特定程序之眾多等效物。 預期本說明書中論述之任何實施例均可關於本發明之任何方法、套組、試劑或組合物來實施，且反之亦然。 已發現，SMARCA2R-LOH與MSI-M常共存於第IV期原發性CRC及LM組織中，表明與該等遺傳變化相關之兩種事件對於肝轉移可起關鍵作用且可牽涉於至少50%之病例 之肝轉移中。
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鹼基部分中之修飾的實例包括烷基化嘌呤及嘧啶、醯化嘌呤或嘧啶或其他熟知之雜環取代基。 磷酸二酯鍵聯之類似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、胺基磷酸酯及其類似物。 術語「核酸分子」亦包括所謂的「肽核酸」，其包含連接至聚醯胺主鏈之天然產生或經修飾核酸鹼基。 如熟習此項技術者所瞭解，該功能性術語包括染色體組序列、cDNA序列或其片段或組合，以及基因產物，包括可人工改變之彼等基因產物。
如請求項27之方法，其中該樣本係選自由冷凍或新鮮組織樣本、FFPE組織樣本、糞便樣本、細胞均質物、一或多個生物流體或其任何組合組成之群。 如請求項17之套組，其中該等偵測試劑偵測一或多個選自由BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250、D18S64、D18S69、MYCL1、D20S82、D20S85、L17835、D8S321、D9S242及D19S394組成之群之單核苷酸、二核苷酸或四核苷酸重複基因座標記。 如請求項1之方法，其中該等四核苷酸重複基因座標記包含MYCL1、D20S82、D20S85、L17835、D8S321、D9S242、D19S394或其任何組合。 如請求項1之方法，其中該等二核苷酸重複基因座標記包含D2S123、D5S346、D17S250、D18S64、D18S69或其任何組合。
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對於EMAST狀態，E表示EMAST陽性且非E表示EMAST陰性。 對於MSI-M狀態，M表示MSI-M，HMSS表示H-MSS且H表示MSI-H。 關於每一標記所用之縮寫如下：S394：D19S394，S85：D20S85，S82：D20S82，S242：D9S242，S321：D8S321，S123：D2S123，S250：D17S250，S346：D5S346，S64：D18S64，S69：D18S69。 腫瘤級別 如本文所用之「生物標記」係指與特定病理學或生理學狀態相關之分子指示物。
除以上基因以外，吾人在清單中增加9種常在癌症組織中發生突變之EMAST標記。 15對於該等基因座中之每一者，擴增來自24例展現MSI-M之LM組織與匹配正常組織的模板DNA且分析其MSI及LOH。 腫瘤級別 總而言之，吾人選擇142種具有二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸重複之基因用於篩檢。 選擇該等基因之主要準則為：1)微衛星重複位於基因之5′-UTR、外顯子、3’UTR或內含子處，2)該等重複足夠大以易受DNA聚合酶錯誤影響，及3)該等重複在長度方面為多形態的以使得可偵測LOH。 NCBI blast搜尋(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)之後訪問Ensemble資料庫(/index.html)以偵測多形現象，鑑別出24種具有多形態四核苷酸重複之基因。
腫瘤級別: TW201300777A – 預測大腸直腸癌轉移復發之生物標記
相比而言，儘管SMARCA2R-LOH在同時LM中之頻率與在第IV期原發性CRC中發現之頻率相比不存在差異，但在第IV期原發性CRC及同時LM中偵測到MSI-M與SMARCA2R-LOH之間的顯著相關。 因此，MSI-M及SMARCA2R-LOH共存於大部分(70~80%)之第IV期原發性CRC、異時LM或同時LM組織中。 統計學分析：為評估特定CRC組之無復發存活，使用Kaplan-Meier方法。 腫瘤級別 術語「組織樣本」(術語「組織」與術語「組織樣本」可互換使用)應理解為包括由一或多個細胞個別地或與任何基質複合或與任何化學物質結合而構成之任何物質。 該定義應包括任何生物或有機物質及其任何細胞子部分、產物或副產物。
對於含有多形態二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸重複之142種基因座(參見下文)，使用來自該等重複之5’與3’端之染色體組序列以藉由線上軟體Prim3Plus設計PCR引子(http：///cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)。 藉由Schuelke所述方法執行對該等基因座之擴增及對MSI或LOH之偵測。 22熱變性之後，使經擴增PCR產物在ABI PRISM 3100 Avant遺傳分析器上電泳且由GeneMapper片段分析軟體進行分析。 圖4A展示77例LM之MSI型態且圖4B展示77例導致圖4A中所列LM之匹配原發性CRC的MSI型態。 圖4C展示9例LM之MSI型態且圖4D展示9例導致圖4C中所列LM之匹配原發性CRC的MSI狀態。