本發明之細胞死亡誘導劑或細胞增殖抑制劑即便於具有BRAF基因突變之癌細胞中亦可有效地誘導細胞死亡或抑制細胞增殖，故而作為針對起因於具有BRAF基因突變之癌細胞之增殖異常之疾病之醫藥組合物之成分有效。 又，藉由調配抑制GST-π之藥物作為有效成分，可製造針對起因於具有BRAF基因突變之癌細胞之增殖異常之疾病之醫藥組合物。 進而，可對包含將所製造之醫藥組合物之有效量投予至必需該有效量之對象之起因於細胞之增殖異常之疾病進行處理、治療。 一種抑制GST-π之產生之藥物之用途，其用於製造起因於具有BRAF基因突變、且對BRAF抑制劑具有耐受性之細胞之增殖異常之疾病之治療用醫藥組合物，上述藥物係選自由RNAi分子、核酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸及表現該等中之至少1種之載體所組成之群中之物質。 本發明係關於一種針對具有BRAF基因突變之細胞(例如癌細胞之一種)之細胞死亡誘導劑、該細胞之增殖抑制劑及起因於該細胞之增殖異常之疾病之治療用醫藥組合物，進而係關於一種對細胞死亡誘導劑及/或細胞增殖抑制劑進行篩選之方法。
近年來，瞭解到獲得了BRAF抑制劑耐受性之黑色素瘤細胞株與黑色素瘤之再發相關。 因此，為了確認GST-π是否促進BRAF抑制劑耐受性黑色素瘤之CRAF依存性，於PLX4720耐受性A375中減弱GST-π。 對GST-π減弱進行了確認，結果於第2天與第3天GST-π表現被抑制(圖6)。
腦膜癌: 腦膜癌病的症狀有哪些和怎麼治療
圖2~係表示於具有BRAF基因突變之黑色素瘤細胞株中對GST-π減弱所帶來之細胞增殖抑制效果進行驗證之結果(細胞數測定結果、西方墨點結果)之特性圖。 如之篩選方法，其包含如下步驟：使被檢測物質與癌細胞接觸之步驟；測定上述細胞中之GST-π之表現量之步驟；及於與被檢測物質之非存在下測定之情形時相比該表現量降低之情形時，選擇作為抑制上述GST-π之藥物之步驟。 BRAF基因係對構成RAS-RAF-MAPK路徑之絲胺酸/蘇胺酸激酶之一種進行編碼之基因。 已知具有V600E突變之BRAF使下游之訊號始終活化，即便不存在來自細胞外部之刺激，亦會導致細胞之增殖。
因此，本發明亦關於一種包含單獨或者組合包含本發明之各種劑或組合物可包含之活性成分之1個或2個以上之容器之組合物之製備 套組、以及以此種套組之形態提供之各種劑或組合物之必需構成要素。 本發明之套組除上述以外，亦包含記載有本發明之各種劑或組合物之製備方法或投予方法等之指示例如說明書或CD(Compact Disc，光碟)、DVD(Digital Versatile Disc，數位多功能光碟)等電子記錄媒體等。 又，本發明之套組可包含用以完成本發明之各種劑或組合物之全部構成要素，亦可未必包含全部構成要素。
腦膜癌: 高中生物【教學視訊】焦點142 細胞膜電位：.
GST基於胺基酸序列，被分類為α、μ、ω、π、θ及ζ之6種同功酶作為代表性者。 其中，尤其是GST-π(glutathione S-transferase pi，亦稱為GSTP1)之表現於各種癌細胞中增大，指出其可能會成為對於一部分抗癌劑之耐受性之一個因素。 實際上已知若使GST-π過度表現，並使針對GST-π之反義DNA(Deoxyribonucleic Acid，脫氧核糖核酸)或GST-π抑制劑作用於表現出藥物耐受性之癌細胞系，則藥劑耐受性被抑制(非專利文獻4~6)。 進而，於最近之報告中報告有若使針對GST-π之siRNA(Small interfering RNA，小干擾RNA)作用於使GST-π過度表現之雄性素非依存性前列腺癌細胞系統，則其增殖被抑制，從而細胞凋亡增大(非專利文獻7)。
又，只要未另行定義，則本說明書中所使用之技術用語及科學用語具有與業者通常理解者相同之意義。 如或之劑，其特徵在於：上述藥物係選自由RNAi(RNA interference，RNA干擾)分子、核酶、反義核酸、DNA/RNA(Ribonucleic Acid，核糖核酸)嵌合聚核苷酸及表現該等中 之至少1種之載體所組成之群中之物質。 投予頻率因所使用之劑或組合物之性狀或包含上述者之對象之條件而有所不同，例如可為1天數次(即1天2、3、4次或5次以上)、1 天1次、每隔數天(即每隔2、3、4、5、6、7天等)、每隔1週、每隔數週(即每隔2、3、4週等)。
腦膜癌: 腦膜癌病的症狀有哪些和怎麼治療
所謂具有BRAF基因突變之細胞，係因BRAF基因具有突變而表現出增殖異常之細胞(典型而言為癌細胞)。 一種起因於具有BRAF基因突變之細胞之增殖異常之疾病之治療用醫藥組合物，其包含如上述~中任一項之劑。 鑒於上述目的，本發明者等人進行了努力研究，結果發現，於具有BRAF基因突變之細胞中，若抑制GST-π，則細胞增殖被強力地抑制，又，即便於對先前公知之BRAF抑制劑表現出耐受性之具有BRAF基因突變之細胞中，若抑制GST-π，則細胞增殖亦被強力地抑制，從而完成了本發明。 於本實施例中，對使抑制GST-π之藥物作用於具有BRAF基因突變並且對BRAF抑制劑具有耐受性之細胞(BRAF抑制劑耐受性細胞)時之細胞增殖抑制效果進行了研究。 尤其是本發明之細胞死亡誘導劑及細胞增殖抑制劑較佳為應用於高表現因BRAF基因具有突變而表現出增殖異常之細胞中之GST-π之細胞(典型而言為高表現GST-π之癌細胞)。 此處，所謂高表現GST-π之癌細胞，意指BRAF基因具有突變而表現出細胞增殖異常之細胞中之GST-π之表現量與正常細胞相比明顯較高之細胞。
- 例如，使被檢測物質與作為癌細胞之一例之具有BRAF基因突變之癌細胞接觸，並測定該細胞中之GST-π之表現量。
- 所謂本說明書所記載之本發明之各種處理方法中之有效量，例如係減少疾病之症狀或使疾病之進行延遲或者停止之量，較佳為抑制或治癒疾病之量。
- 圖5係表示於具有BRAF基因突變且對BRAF抑制劑具有耐受性之黑色素瘤細胞株中對GST-π減弱所帶來之細胞增殖抑制效果進行驗證之結果之特性圖。
- 作為被檢測物質，例如可為如微生物或者來自培養液之萃取物般包含未鑑定之物質之構成，亦可為以特定之組成比包含已知之組合物 般之構成。
- 根據圖3得知，於使GST-π siRNA單獨作用於大腸癌細胞株(具有BRAF基因突變之CACO-2株)之情形時，與使PLX4720與siControl一併作用於該大腸癌細胞株之情形時相比，於將該等GST-π siRNA及PLX4720併用後作用於該細胞株之 情形時顯示出細胞增殖抑制效果顯著。
KRAS等之RAS形成使CRAF或BRAF等之RAF活化，RAF接下來使MEK活化，MEK使MAPK活化之級聯(非專利文獻1及2)。 同時具有BRAF突變及KRAS突變之案例罕見，處於BRAF突變及KRAS突變相互排斥之關係(非專利文獻3)。 如上所述，藉由西方墨點確認使GST-π siRNA作用於PLX4720耐受性A375細胞時之GST-π之表現。
腦膜癌: 高中生物【教學視訊】焦點142 細胞膜電位：.
本說明書所記載之本發明之各種劑或組合物(包含各種醫藥組合物)能以任一形態供給，就保存穩定性之觀點而言，能以可於使用時調製之形態例如於醫療現場或其附近可由醫師及/或藥劑師、護士、或者其他醫務輔助人員等製備之形態提供。 該形態於本發明之劑或組合物包含脂質或蛋白質、核酸等難以實現穩定之保存之成分時尤其有用。 於此情形時，本發明之劑或組合物係作為包含該等所必需之構成要素之至少1種之1個或2個以上之容器而提供，且係於使用之前、例如24小時前以內、較佳為3小時前以內、並且更佳為即將要使用之前製備。
本發明之細胞死亡誘導劑及細胞增殖抑制劑包含抑制GST-π之藥物作為有效成分。 本發明之細胞死亡誘導劑及細胞增殖抑制劑對具有BRAF基因突變之細胞表現出細胞死亡誘導效果及細胞增殖抑制效 果。 一種抑制GST-π之產生之藥物之用途，其用於製造具有BRAF基因突變、且對BRAF抑制劑具有耐受性之細胞之細胞增殖抑制劑，上述藥物係選自由RNAi分子、核酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸及表現該等中之至少1種之載體所組成之群中之物質。 腦膜癌 該醫藥組合物對處理起因於具有BRAF基因突變之癌細胞之增殖異常之疾病有效。 作為起因於具有BRAF基因突變之癌細胞之疾病，並未限定，可列舉高表現GST-π之癌等，於較多之情形時，具有BRAF基因突變之癌包含於高表現GST-π之癌中。
腦膜癌: 高中生物【教學視訊】焦點142 細胞膜電位：.
於作為另外之製劑而投予之情形時，可於其他製劑之前、與其他製劑同時、或其他製劑之後投予包含其他有效成分之製劑。 作為抑制GST-π之產生或活性之藥物，就特異性之高程度或副作用之可能性之低程度之方面而言，較佳為針對將GST-π編碼之DNA之RNAi分子、核酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸及表現該等之載體。 於在本說明書中使用之情形時，GST-π係指將由GSTP1基因編碼之麩胱甘肽結合作為觸媒之酵素。 腦膜癌 GST-π存在於包含人在內之各種動物中，其序列資訊亦為公知(例如人：NM_000852，大鼠：NM_012577，小鼠：NM_013541等。編號表示NCBI資料庫之登錄編號，括號外為鹼基序列之編號，括號內為胺基酸序列之編號)。 作為一例，將登錄於資料庫中之人GST-π基因之編碼區域之鹼基序列表示為序列編號1，將該人GST-π基因所編碼之人GST-π蛋白質之胺基酸序列表示為序列編號2。 然而，並無與於上述具有BRAF基因突變之細胞中GST-π之表現與細胞增殖或者細胞死亡之關係或與訊號傳遞相關之GST-π之作用等相關之見解。
- 根據該結果，可期待可防止或者減少BRAF抑制劑耐受性細胞成為一個因素之疾病例如黑色素瘤之再發等效果。
- 於此情形時，本發明之劑或組合物係作為包含該等所必需之構成要素之至少1種之1個或2個以上之容器而提供，且係於使用之前、例如24小時前以內、較佳為3小時前以內、並且更佳為即將要使用之前製備。
- 即，於具有突變之BRAF基因(亦存在稱為突變型BRAF基因之情形)中包含對因該突變而導致絲胺酸/蘇胺酸激酶活性亢進之突變型BRAF進行編碼之基因。
- 其中，尤其是GST-π(glutathione S-transferase pi，亦稱為GSTP1)之表現於各種癌細胞中增大，指出其可能會成為對於一部分抗癌劑之耐受性之一個因素。
- 本發明之細胞死亡誘導劑或細胞增殖抑制劑即便於具有BRAF基因突變之癌細胞中亦可有效地誘導細胞死亡或抑制細胞增殖，故而作為針對起因於具有BRAF基因突變之癌細胞之增殖異常之疾病之醫藥組合物之成分有效。
- 尤其是本發明之細胞死亡誘導劑及細胞增殖抑制劑較佳為應用於高表現因BRAF基因具有突變而表現出增殖異常之細胞中之GST-π之細胞(典型而言為高表現GST-π之癌細胞)。
可是，如上所述，抑制GST-π之藥物對具有BRAF基因突變之細胞表現出細胞死亡誘導及/或細胞增殖抑制。 因此，可將對GST-π之抑制作為指標，對具有BRAF基因突變之細胞之細胞死亡誘導劑及/或細胞增殖抑制劑進行篩選。 即，可抑制GST-π之物質成為具有BRAF基因突變之細胞(典型而言為癌細胞)之細胞死亡誘導劑及/或細胞增殖抑制劑之候補物質。 作為此種化合物，可使用有機化合物(胺基酸、多肽或其衍生物、低分子化合物、糖、高分子化合物等)、無機化合物等。
腦膜癌: 腦膜癌病的症狀有哪些和怎麼治療
作為投予路徑，包含包括經口及非經口之兩者之各種路徑，例如經口、靜脈內、肌肉內、皮下、局部、腫瘤內、直腸、動脈內、門靜脈內、心室內、經黏膜、經皮、鼻內、腹腔內、肺內及子宮內等路徑。 腦膜癌 腦膜癌病(meningeal carcinomatosis，MC)是指惡性腫瘤瀰漫性或多灶性軟腦膜播散或浸潤，臨床表現為腦、腦神經和脊髓受損的症狀，為中樞神經系統轉移瘤的一種… 國外大量研究資料證實，未經治療的MC患者症狀不能自行緩解，病程是不可逆的。 化療的途徑包括腰椎穿刺和腦室導管注射，常用藥物有甲氨蝶呤、阿糖胞甘(A-rac)及塞替哌，宜小劑量，多次給藥。 國外學者(Wasserstrom，1982)推薦的治療方案為經Ommaya囊甲氨蝶呤(或阿糖胞甘)單一給藥與局部放療聯合。 腦膜癌病是惡性腫瘤瀰漫性或多灶性軟腦膜播散或浸潤，為中樞神經系統轉移瘤的一種特殊分佈類型，本病常發生於原發灶確診後數月，數年，也有10餘年者。
載體較佳為至少包含增強所擔載之核酸之表現之啟動子，於此情形時，該核酸較佳為與該啟動子可作動地連結。 所謂核酸可作動地連結於啟動子，意指以藉由啟動子之作用而適當產生該核酸所編碼之蛋白質之方式配置該核酸與啟動子。 載體既可於宿主細胞內複製，亦可無法複製，又，基因之轉錄既可於宿主細胞之核外進行，亦可於核內進行。 再者，上述細胞凋亡等細胞死亡誘導或細胞增殖抑制方法均可為in vitro之方法，亦可為in vivo(活體內)之方法。
腦膜癌: 腦膜癌病的症狀有哪些和怎麼治療
目前，針對確認到具有V600E突變之BRAF之癌，認為利用針對具有V600E突變之BRAF之抑制劑所進行之治療有效。 作為此種抑制劑，已知有威羅非尼(Vemurafenib)或PLX4720等。 然而，存在因持續投予該抑制劑而導致癌細胞對該抑制劑獲得耐受性之情形，從而治療效果被限定。 腦膜癌 因此，針對具有BRAF基因突變之癌細胞，要求代替該等抑制劑之更有效之細胞死亡誘導劑或增殖抑制劑。 一種抑制GST-π之產生之藥物之用途，其用於製造具有BRAF基因突變、且對BRAF抑制劑具有耐受性之細胞之細胞死亡誘導劑，上述藥物係選自由RNAi分子、核酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合聚核苷酸及表現該等中之至少1種之載體所組成之群中之物質。
作為多肽之衍生物，可列舉對修飾基加成而獲得之修飾多肽、藉由改變胺基酸殘基而獲得之變異體多肽等。 進而，此種化合物既可為單一化合物，亦可為化合物基因庫、基因基因庫之表現產物、細胞萃取物、細胞培養上清液、醱酵微生物產生物、海洋生物萃取物、植物萃取物等。 即，「抑制GST-π之藥物」並不限定於RNAi分子等之核酸，亦包含任何化合物。 如請求項10之篩選方法，其包括如下步驟：使被檢測物質與具有BRAF基因突變、且對BRAF抑制劑具有耐受性之細胞接觸之步驟；測定上述細胞中之GST-π之表現量之步驟；及於與被檢測物質之非存在下測定之情形時相比該表現量降低之情況下，選擇其作為抑制上述GST-π之產生之藥物之步驟。
腦膜癌: 高中生物【教學視訊】焦點142 細胞膜電位：.
作為被檢測物質，例如可為如微生物或者來自培養液之萃取物般包含未鑑定之物質之構成，亦可為以特定之組成比包含已知之組合物 般之構成。 又，作為被檢測物質，可為蛋白質、核酸、脂質、多糖類、有機化合物及無機化合物之任一者。 於本說明書所記載之本發明之處理方法中投予之活性成分之具體之用量可考慮與需要處理之對象相關之各種條件例如症狀之嚴重程度、對象之一般健康狀態、年齡、體重、對象之性別、飲食、投予之時期及頻率、併用之醫藥、對治療之反應性、劑形、及對治療之適應性等而確定。 例如，於大量大腸癌(5~15%)或黑色素瘤(約60%)中確認到具有V600E突變之BRAF基因。
腦膜癌: 腦膜癌病的症狀有哪些和怎麼治療
該量為公知或可藉由使用培養細胞等之in vitro(活體外)試驗或小鼠、大鼠、狗或豬等模型動物中之試驗適當決定，業者熟知此種試驗法。 細胞凋亡之誘導可利用各種已知之方法例如DNA片段化、膜聯蛋白V對細胞膜之結合、線粒體膜電位之變化、半胱天冬酶之活化等細胞凋亡特有之現象之檢測或TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，末端脫氧核苷酸轉移酶介導之dUTP缺口末端標記)染色等進行評價。 又，細胞增殖之抑制可利用各種已知之方法例如經時性之活細胞數之計數、腫瘤之尺寸、體積或重量之測定、DNA合成量之測定、WST-1法、BrdU(溴脫氧尿苷)法、3H胸苷摻入法等進行評價。 例如於1次投予使用複數個單位之組合物之情形時，1個單位之組合物中所調配之有效成分之量可設為1次投予所必需之有效成分之量之複數分之一。 腦膜癌 可是，將包含麩胱甘肽作為觸媒之酵素之一之麩胱甘肽-S-轉移酶已知為使藥劑等物質與麩胱甘肽偶合而將其製成水溶性之物質之酵素。
腦膜癌: 高中生物【教學視訊】焦點142 細胞膜電位：.
例如上述有效量可為對該細胞集團中之細胞之1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、6%以上、8%以上、10%以上、12%以上、15%以上、20%以上、進而25%以上等造成細胞凋亡或增殖抑制之量。 報告有若使針對GST-π之siRNA作用於KRAS具有突變之癌細胞系，則Akt之活化被抑制，自噬增大，但細胞凋亡之誘導成為中等程度(非專利文獻11)。 於專利文獻1中揭示有藉由將抑制GST-π之藥物與3-甲基腺嘌呤等自噬抑制劑作為活性成分，可誘導癌細胞之細胞凋亡。
腦膜癌: 高中生物【教學視訊】焦點142 細胞膜電位：.
即，使用於GST-π siRNA之轉染後之上述各時點採取之細胞進行GST-π減弱之西方墨點解析。 又，用語「處理」於在本說明書中使用之情形時，包含以疾病之治癒、暫時之緩解或預防等為目的之醫學上所容許之所有種類之預防性及/或治療性干擾。 例如，「處理」之用語包含包括疾病之進行之延遲或停止、病變之消退或消失、發病之預防或再發之防止等各種目的之醫學上所容許之干擾。
腦膜癌: 腦膜癌病的症狀有哪些和怎麼治療
又，根據本發明之細胞增殖抑制劑，針對具有BRAF基因突變之細胞，可非常強力地抑制細胞增殖。 因此，本發明之細胞增殖抑制劑可作為起因於具有BRAF基因突變之細胞之增殖異常之疾病之治療用 之醫藥組合物而發揮非常高之藥效。 腦膜癌 根據本發明之細胞死亡誘導劑，針對具有BRAF基因突變之細胞，可非常強力地誘導細胞死亡。
腦膜癌: 腦膜癌病的症狀有哪些和怎麼治療
但細胞學檢查並非首次都能發現腫瘤細胞，故對臨床高度懷疑MC者需反覆多次做腦脊液細胞學檢查以提高陽性率。
腦膜癌: 高中生物【教學視訊】焦點142 細胞膜電位：.
又，進而已知GST-π有助於針對經活性氧種誘導之細胞死亡之保護作用(非專利文獻 10)。 例如，使被檢測物質與作為癌細胞之一例之具有BRAF基因突變之癌細胞接觸，並測定該細胞中之GST-π之表現量。 於與被檢測物質之非存在下測定之表現量相比使被檢測物質接觸時之表現量降低之情形時，可選擇該被檢測物質作為抑制GST-π之藥物之候補物質。 又，進而，可提供一種包含投予有效量之抑制GST-π之藥物之細胞死亡之誘導方法或細胞增殖之抑制方法。 又，藉由調配抑制GST-π之藥物作為有效成分，可製造細胞死亡誘導劑、細胞增殖抑制劑、細胞死亡誘導組合物或細胞增殖抑制組合物。
腦膜癌: 高中生物【教學視訊】焦點142 細胞膜電位：.
尤其是本發明之細胞死亡誘導劑或細胞增殖抑制劑即便對於具有BRAF基因突變之細胞中對BRAF抑制劑獲得了耐受性之細胞，亦可有效地誘導細胞死亡或抑制細胞增殖。 因此，本發明之細胞死亡誘導劑或細胞增殖抑制劑作為針對起因於具有BRAF基因突變並且對BRAF抑制劑具有耐受性之癌細胞之增殖異常之疾病之醫藥組合物之成分有效。 又，藉由調配抑制GST-π之藥物作為有效成分，可製造針對起因於具有BRAF基因突變並且對BRAF抑制劑具有耐受性之癌細胞之增殖異常之疾病之醫藥組合物。 進而，可對包含將所製造之醫藥組合物之有效量投予至必需該有效量之對象、即利用BRAF抑制劑之治療效果降低之患者之起因於細胞之增殖異常之疾病進行處理、治療。
腦膜癌: 腦膜癌病的症狀有哪些和怎麼治療
將針對CACO-2測量細胞數之結果示於圖3，將針對SK-MEL-28及A2058測量細胞數之結果示於圖4。 根據圖3得知，於使GST-π siRNA單獨作用於大腸癌細胞株(具有BRAF基因突變之CACO-2株)之情形時，與使PLX4720與siControl一併作用於該大腸癌細胞株之情形時相比，於將該等GST-π siRNA及PLX4720併用後作用於該細胞株之 情形時顯示出細胞增殖抑制效果顯著。 所謂本說明書所記載之本發明之各種處理方法中之有效量，例如係減少疾病之症狀或使疾病之進行延遲或者停止之量，較佳為抑制或治癒疾病之量。 該量可藉由使用培養細胞等之in vitro試驗或小鼠、大鼠、狗或豬等模型動物之試驗適當確定，業者熟知此種試驗法。 又，本發明之處理方法所使用之藥物之用量對於業者而言為公知或可藉由上述試驗等適當確定。