在本實驗中，進一步在細胞培養組合物中添加補體C3（Sigma-Aldrich，204885），以包含補體C3的細胞培養組合物作為培養液來培養ARPE-19。 參閱圖3與圖4，本新型細胞承載裝置1之第二實施例包含一彈性膜2、一支撐結構3、一孔道4及一承載柱6。 該彈性膜2為上述製得的聚氨酯彈性膜，且該彈性膜2上附著有附著型細胞9(大小僅為示意)，可供模擬細胞在會頻繁拉伸的肌肉或皮膚表面之動態生長環境。 參閱圖1與圖2，本新型細胞承載裝置1之第一實施例包含一彈性膜2、一支撐結構3、四孔道4及一底座5。 該彈性膜2為上述製得的聚氨酯彈性膜，且該彈性膜2上附著有附著型細胞9(大小僅為示意)，可供模擬細胞在會頻繁膨脹及縮小的心、肺或胃等器官壁之動態生長環境。
- 在其他實施例中，每一毫升之細胞培養組合物可包含10微克的補體C3 。
- 使用本發明實施例之細胞培養組合物所培養的細胞可包含任意體細胞。
- 接著，將白細胞層與HEP buffer（140 mM NaCl、2.7mM KCl、3.8 mM HEPES、5 mM EGTA，pH 7.4）以1：1的比例均勻混合，再加入Prostaglandin E1使其濃度為1 μM以防止血小板活化。
- 可藉由量測試鹵靈的光吸收值或螢光值來評估細胞的增生率（cell proliferation）。
- 營養添加物可包含胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）、鹽類、胺基酸、馬血清、人類血清、維生素、葡萄糖、生長因子、蛋白質、動物體萃取物、碳水化合物、肌醇、巰乙醇或葉酸，但不以此為限。
- 接著，在培養皿中加入0.25%之胰蛋白酶並使胰蛋白酶在37℃下反應5分鐘，再加入培養液以終止胰蛋白酶的反應。
- 接著，將血液離心使血液分層，例如以1500 g離心10分鐘使血液分層為紅血球層、膠體層、白細胞層（buffy coat）及血漿層，將白細胞層收集至新的離心管中，其中白細胞層包含單核球細胞及血小板。
在不脫離本發明之精神和範圍內，所為之更動與潤飾，均屬本發明之專利保護範圍。 於以下實施方式中詳細敘述本發明之詳細特徵及優點，其內容足以使任何熟習相關技藝者了解本發明之技術內容並據以實施，且根據本說明書所揭露的內容、申請專利範圍及圖式，任何熟習相關技藝者可輕易理解本發明相關之目的及優點。 腎臟細胞 以下實施例係進一步詳細說明本發明之觀點，但非以任何觀點限制本發明之範疇。
腎臟細胞: TWM517199U – 細胞承載裝置及細胞培養系統
將人類肌腱細胞以每孔2×104個細胞的密度於實施例4-1至4-4之細胞培養組合物中培養24或48小時。 將自然殺手細胞以每孔2×104個細胞的密度於實施例5-1至5-4之細胞培養組合物中培養24或48小時。 培養完成後，使用磷酸鹽緩衝液清洗各細胞，並將培養液更換為含有阿爾瑪藍的培養液，培養3小時。 培養完成後，以OD530/595的波長量測螢光，計算各細胞的增生率。 在本發明部分實施例中，培養動物細胞時添加動物細胞的粒線體至培養基中。 提供粒線體的動物細胞可包含脂肪幹細胞、單核球細胞、胚胎幹細胞、間質幹細胞、造血幹細胞、CD34+幹細胞、骨髓幹細胞、骨骼肌細胞、肝臟細胞、腎臟細胞、血小板、纖維母細胞、內皮細胞等具有粒線體的細胞。
接著，於孔盤中加入AGE，使幹細胞在含有濃度為400 μg/mL的AGE的培養液中培養4小時。 接著，將含有AGE的細胞培養液移除，加入實施例之細胞培養組合物，使幹細胞在含有不同粒線體濃度的細胞培養組合物中培養24小時。 細胞培養組合物中粒線體的濃度為0、1 腎臟細胞 μg/mL、15 μg/mL或40 μg/mL。 培養完成後，使用磷酸鹽緩衝液清洗各細胞並使用SA-β-gal套組進行細胞老化的評估。
腎臟細胞: TW202200781A – 細胞培養組合物及其用途
根據上述實驗結果，由對照組可知，在細胞培養基中添加血小板可提高細胞增生率，且增生率隨著血小板的數量增加而提升。 由實施例8-1至8-3可知，使用含有粒線體的細胞培養組合物來培養細胞，可使細胞具有提高的增生率，且增生率隨著粒線體的濃度增加而提升，表示含有粒線體的細胞培養組合物確實有助於細胞的生長。 由對照組8-1、實施例8-3及實施例8-4可知，使用含有粒線體及血小板的細胞培養組合物來培養細胞，可進一步提升細胞的增生率。 實施例8-3及實施例8-4證實在粒線體濃度皆為40 μg/mL的情況下，添加1×106個/mL之血小板可使細胞增生率進一步提升。 實施例8-4及對照組8-1證實在血小板數量皆為1×106的情況下，添加40 μg/mL之粒線體可使細胞增生率超過血小板數量為1×108（對照組8-3）始能達到的效果。 因此，相較於僅添加血小板或僅添加粒線體的細胞培養組合物，同時含有粒線體及血小板的細胞培養組合物在提升細胞增生率上可具有加乘的效果。
人類肌腱細胞的實驗結果請參考表9及圖4，圖4顯示使用實施例之細胞培養組合物培養人類肌腱細胞的細胞增生率，培養時間為24小時及48小時。 自然殺手細胞的實驗結果請參考表10及圖5，圖5顯示使用實施例之細胞培養組合物培養自然殺手細胞的細胞增生率，培養時間為24小時及48小時。 圖1A至圖3中，#表示相對初始對照組具有顯著差異（P＜0.05），##表示相對初始對照組具有高顯著差異（P＜0.01），###表示相對初始對照組具有非常顯著差異（P＜0.001）。 圖4及圖5中，#表示相對於對照組具有顯著差異（P＜0.05）。 本發明一實施例所使用之粒線體取自人類脂肪幹細胞（adipose-derived stem cell，ADSC）。
腎臟細胞: TWM517199U – 細胞承載裝置及細胞培養系統
圖2顯示使用實施例之細胞培養組合物培養HepG2的細胞增生率，培養時間為24小時。 圖3顯示使用實施例之細胞培養組合物培養MDCK的細胞增生率，培養時間為24小時。 圖4顯示使用實施例之細胞培養組合物培養人類肌腱細胞的細胞增生率，培養時間為24小時及48小時。 圖5顯示使用實施例之細胞培養組合物培養自然殺手細胞的細胞增生率，培養時間為24小時及48小時。 圖6顯示使用實施例之細胞培養組合物培養受損或老化的ADSC的老化細胞比例。
如請求項5所述的細胞承載裝置，其中，該脂肪族多異氰酸酯是選自於異佛酮二異氰酸酯、1,6-己二異氰酸酯或其組合。 如請求項1所述的細胞承載裝置，其中，該聚氨酯是使聚醚多元醇與脂肪族多異氰酸酯反應，接著與鏈延長劑反應而得。 該孔道4是連通至該彈性膜2底部且環繞該承載柱6，並利用一外接的真空設備(圖未示)透過該等孔道4進行抽氣，以使該彈性膜2承載有該附著型細胞9的部分受到水平方向的應力而向外伸展；當停止抽氣時，該彈性膜2會回復到抽氣前非伸展的狀態。
腎臟細胞: TW202200781A – 細胞培養組合物及其用途
根據本發明一實施例，藉由在細胞培養基中添加粒線體，可幫助細胞生長、提高細胞的增生率。 對於受損或老化的細胞而言，根據本發明一實施例亦能改善受損或老化的細胞的生長、降低老化細胞比例。 除此之外，根據本發明一實施例還能改善受損或老化的細胞的功能。 在學術方面，本發明確保細胞的生長效率及穩定性有助於進行後續的研究或實驗，以奠定科學發展、生物學研究的基礎。 腎臟細胞 在產業方面，本發明確保細胞的生長效率及穩定性有助於穩定產率及良率，可降低細胞培養成本並控管產品品質，以達成利益最大化。
可藉由量測試鹵靈的光吸收值或螢光值來評估細胞的增生率（cell proliferation）。 試鹵靈的光吸收值或螢光值愈高，表示細胞量越多，細胞的增生率愈高。 因此，本實驗使用阿爾瑪藍作為評估細胞增生率或細胞存活率的指標。
腎臟細胞: TW202200781A – 細胞培養組合物及其用途
如請求項1所述之細胞培養組合物，更包含血小板，其中每一毫升的該細胞培養組合物包含1×106至1×108個血小板。 在細胞培養組合物中，每一毫升之細胞培養組合物可包含0.1微克至20微克的補體C3，但不以此為限。 在其他實施例中，每一毫升之細胞培養組合物可包含10微克的補體C3 。
- 圖1A及圖1B顯示使用實施例之細胞培養組合物培養ARPE-19的細胞增生率，圖1A之培養時間為24小時，圖1B之培養時間為48小時。
- 圖8顯示使用僅含血小板之對照組之細胞培養組合物培養CCD-996SK的細胞增生率，培養時間為24小時及48小時。
- 圖6顯示使用實施例之細胞培養組合物培養受損或老化的ADSC的老化細胞比例。
- 鹽類包含鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、氯鹽、碳酸鹽、丙酮酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽或無機鹽，但不以此為限。
- 圖11顯示使用含粒線體及補體C3之實施例之細胞培養組合物培養ARPE-19的細胞增生率，培養時間為24小時及48小時。
- 由於生物體中許多細胞所生長的位置是處於動態環境，例如：心、肺或胃等器官壁會隨著壓力而膨脹及縮小，肌肉或皮膚表面會隨著壓力而拉伸，因此，當對於細胞進行體外觀察時，需要模擬出一個符合生物體的動態環境，以承載及培養細胞。
ARPE-19的實驗結果請參考表6及圖1A及圖1B，圖1A及圖1B顯示使用實施例之細胞培養組合物培養ARPE-19的細胞增生率，圖1A之培養時間為24小時，圖1B之培養時間為48小時。 HepG2的實驗結果請參考表7及圖2，圖2顯示使用實施例之細胞培養組合物培養HepG2的細胞增生率，培養時間為24小時。 MDCK的實驗結果請參考表8及圖3，圖3顯示使用實施例之細胞培養組合物培養MDCK的細胞增生率，培養時間為24小時。
腎臟細胞: TWM517199U – 細胞承載裝置及細胞培養系統
在本實驗中，使用醣化終產物（advanced glycation end product，AGE）誘導幹細胞損傷或老化，再使用實施例之細胞培養組合物作為培養液來培養受損或老化的幹細胞。 並且，透過SA-β-gal套組來評估包含粒線體的細胞培養組合物對於受損或老化的幹細胞的影響，並以老化細胞比例（%）來表示老化程度。 本實驗使用之幹細胞包含脂肪幹細胞（Adipose-derived stem cell，ADSC）及羊膜幹細胞（Amniotic membrane stem cell，AMSC）。 上述實驗結果顯示，使用含有粒線體的細胞培養組合物來培養細胞，可使細胞具有提高的增生率，且增生率隨著粒線體的濃度增加而提升，表示含有粒線體的細胞培養組合物確實有助於細胞的生長。 並且，透過阿爾瑪藍檢測試劑來評估包含粒線體的細胞培養組合物對於細胞生長的影響，並以增生率（亦稱為細胞增生率）來表示。
使用不含粒線體的培養液，將幹細胞培養至其體積為培養皿的八分滿時，移除培養皿中的培養液並使用磷酸鹽緩衝液（phosphate buffered saline，PBS）潤洗幹細胞。 接著，在培養皿中加入0.25%之胰蛋白酶並使胰蛋白酶在37℃下反應5分鐘，再加入培養液以終止胰蛋白酶的反應。 接者，將培養皿中的各細胞及培養液移至離心管中，以每分鐘轉速1000（Revolutions Per Minute，rpm）離心5分鐘後，移除上清液。 接著，將幹細胞以每孔1.5×104個細胞的密度培養24小時。
腎臟細胞: TWM517199U – 細胞承載裝置及細胞培養系統
幹細胞培養液包含Keratinocyte SFM 溶液（Gibco）、bovine pituitary extract（BPE，Gibco）、重量百分濃度10%之胎牛血清（HyClone）。 首先，在培養皿中將人類脂肪幹細胞培養至細胞數為1.5×108個細胞，再以杜氏磷酸鹽緩衝液（DPBS）沖洗培養皿中的人類脂肪幹細胞。 接著，移除培養皿中的杜氏磷酸鹽緩衝液後，在培養皿中加入細胞剝離用之胰蛋白酶（Trypsin），並在37℃下反應3分鐘後，再加入幹細胞培養液以終止反應。 接著，將人類脂肪幹細胞自培養皿中沖洗下來後打散，以600 g離心10分鐘後，移除上清液。 接著，將離心後留下的人類脂肪幹細胞及80毫升之IBC-1緩衝液（225 mM甘露醇、75mM蔗糖、0.1 mM EDTA、30 mM Tris-HCl pH 腎臟細胞 7.4）加入均質器中，並在冰上以均質器對人類脂肪幹細胞進行研磨15次。 接著，以1000 g離心研磨後的人類脂肪幹細胞15分鐘，將上清液收集至另一離心管，再以9000 g再次離心收集的上清液10分鐘，移除再次離心後得到的上清液，獲得之沉澱物即為粒線體。
圖8至圖10中，#表示相較於控制組具有顯著差異（P＜0.05），##表示相較於控制組具有高顯著差異（P＜0.01），###表示相較於控制組具有非常顯著差異（P＜0.001）。 ADSC的實驗結果請參考表13及圖6，圖6顯示使用實施例之細胞培養組合物培養受損或老化的ADSC的老化細胞比例。 AMSC的實驗結果請參考表14及圖7，圖7顯示使用實施例之細胞培養組合物培養受損或老化的AMSC的老化細胞比例。 老化細胞比例為在單位面積中老化細胞的數量佔所有細胞的數量的百分比，以代表老化程度。 圖6至圖7中，縱軸為老化細胞比例（%），#表示相對對照組具有顯著差異（P＜0.05），##表示相對對照組具有高顯著差異（P＜0.01），###表示相對對照組具有非常顯著差異（P＜0.001）。
腎臟細胞: TW202200781A – 細胞培養組合物及其用途
較佳地，該聚氨酯是使聚醚多元醇與脂肪族多 異氰酸酯反應，接著與鏈延長劑反應而得。 腎臟細胞 更佳地，該脂肪族多異氰酸酯是選自於異佛酮二異氰酸酯、1,6-己二異氰酸酯或其組合。 該鏈延長劑是選自於1,4-丁二醇(1,4-BD)、乙二醇或其組合。